o-GlcNAc與IBD的相關(guān)性及白頭翁湯對(duì)IBD的干預(yù)機(jī)制.pdf

1、背景:炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD），包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativeeolitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease，CD)，是一種病因尚未完全明確的慢性炎癥性腸病，臨床表現(xiàn)是持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的腹瀉、粘液膿血便、腹痛和里急后重。但由于對(duì)本病的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前還沒有療效顯著、副作用小的治療藥物，故尋找新型有效的治療藥物是目前本研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。
　　白頭翁

2、湯(Pulsatillae Decoction，PD)治療炎癥性腸病的不良反應(yīng)發(fā)生率較低，安全性較高，本實(shí)驗(yàn)為白頭翁湯治療炎癥性腸病提供理論依據(jù)，為臨床用藥提供理論指導(dǎo)。蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾是存在于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中的一種翻譯后修飾方式，是指N-乙酰葡萄糖胺(N-acetyglucosamine，GlcNAc)以O(shè)-糖苷鍵與蛋白質(zhì)的絲氨酸（serine，Ser）/蘇氨酸(threonine，Thr)的羥基相連。其在感染、氧化應(yīng)激等多

3、種病理狀態(tài)下可以充當(dāng)“應(yīng)激感受器”的角色，通過抑制炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞凋亡、減少蛋白質(zhì)降解、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等多種途徑對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用。我們主要就蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾與炎癥性腸病的相關(guān)性進(jìn)行探討。
　　第一部分 TNBS誘導(dǎo)炎癥性腸病大鼠模型的建立
　　目的:建立TNBS誘導(dǎo)的炎癥性腸病動(dòng)物模型，并分析其劑量效應(yīng)，找出建造模型的合理劑量。
　　方法:實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照組（50％乙醇溶液），含25mg/kg、50mg/kg

4、、100mg/kg、150mg/kgTNBS的50％乙醇溶液組，每組大鼠10只，造模成功后，記錄大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(diseaseactivity index，DAI)，造模后第七天處死大鼠，計(jì)算結(jié)腸組織大體形態(tài)損傷指數(shù)(Colonmacroscopic damage index，CMDI)，并行病理切片檢查，記錄組織損傷指數(shù)(tissue damageindex，TDI)，檢測(cè)血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis fact

5、or-α，TNF-α)水平，行結(jié)腸組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性測(cè)定。
　　結(jié)果:造模過程中150mg/kg TNBS組大鼠死亡3只，其余組大鼠未見死亡。1、造模后對(duì)照組、25mg/kg TNBS組大鼠出現(xiàn)一過性炎癥損傷，第三天開始炎癥明顯減輕。50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg TNBS組出現(xiàn)持續(xù)的炎癥損傷表現(xiàn)，包括一般情況差、體質(zhì)量逐漸減少、腹瀉、便血等。2、50mg/kg、10

6、0mg/kg、150mg/kg組DAI、CMDI、TDI評(píng)分明顯高于對(duì)照組、25mg/kg TNBS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且隨著TNBS用量的增大，DAI、CMDI、TDI評(píng)分越高;而對(duì)照組與25 mg/kg TNBS組比較DAI、CMDI、TDI無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。3、50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg TNBS組大鼠TNF-α濃度明顯高于對(duì)照組與25 mg/kg TNBS組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

7、義(P＜0.01)，且隨著TNBS用量的增大，TNF-α濃度升高。4、造模術(shù)后第7天時(shí)各組大鼠結(jié)腸組織內(nèi)MPO活力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg TNBS組大鼠結(jié)腸組織中MPO活力顯著高于乙醇對(duì)照組、25mg/kg TNBS組(P＜0.01)，25mg/kg TNBS模型組與對(duì)照組比較無差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:應(yīng)用含100mg/kg TNBS的50％乙醇溶液最適宜制作炎癥性腸病大鼠模型。

8、>　　第二部分探討0-GIcNAc與IBD的相關(guān)性及白頭翁湯對(duì)IBD的干預(yù)機(jī)制
　　目的:探討白頭翁湯及蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾對(duì)TNBS誘導(dǎo)的炎癥性腸病大鼠的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，為臨床治療IBD提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:將50只大鼠隨機(jī)分為:模型組、白頭翁湯組(Pulsatillae Decoction，PD)、谷氨酰胺組(Glutamine，Gln)、葡萄糖胺組（Glucosamine，GleN）、四氧嘧啶組(All

9、oxan，ALX)，每組10只，采用含100mg/kgTNBS的50％乙醇溶液復(fù)制IBD模型。給藥7天，記錄大鼠DAI、CMDI、TDI， ELISA檢測(cè)血清TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-27、IL-4、IL-10水平，免疫印跡法(Western Blot，WB)檢測(cè)大鼠腸黏膜鈣衛(wèi)蛋白(Calprotectin)含量，流式細(xì)胞技術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)大鼠PBMC中O-GlcNAc糖鏈及核轉(zhuǎn)錄因子kapp

10、a B p65(nuclear factor Kappa B，NF-κB p65)的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1、白頭翁湯組對(duì)比模型組大鼠，前者可明顯減低DAI、CMDI、TDI評(píng)分(P＜0.01)，降低血清TNF-α、IFN-γ、 IL-6、Il-27水平(P＜0.01)，下調(diào)PBMC中NF-κB p65的表達(dá)(P＜0.01)，減少腸黏膜組織鈣衛(wèi)蛋白含量(P＜0.01)，增加IL-4、IL-10表達(dá)(P＜0.01)。

11、r>　　2、谷氨酰胺組、葡萄糖胺組對(duì)比模型組大鼠，DAI、CMDI、TDI評(píng)分及血清TNF-α、IFN-γ、IL-6、Il-27及PBMC中NF-κB p65的表達(dá)水平、腸黏膜組織鈣衛(wèi)蛋白量減低(P＜0.01)，血清IL-4、IL-10水平升高明顯，差異顯著(P＜0.01);PBMC中O-GlcNAc糖鏈的表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　3、四氧嘧啶組對(duì)比模型組大鼠，DAI、CMDI、TDI及血清TNF-α

12、、IFN-γ、 IL-6、IL-27水平、腸黏膜組織鈣衛(wèi)蛋白含量明顯升高(P＜0.01);血清IL-4、IL-10水平減低(P＜0.01)，PBMC中NF-κB p65的表達(dá)量上調(diào)(P＜0.01);PBMC中O-GlcNAc糖鏈的表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　結(jié)論:1、白頭翁湯能通過抑制NF-κB p65的活性，減少了促炎細(xì)胞因子的釋放，上調(diào)抑炎因子水平，使細(xì)胞因子達(dá)到平衡狀態(tài)，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，改善腸