23kD肝再生增強(qiáng)因子對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞自噬水平的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、第一部分、構(gòu)建穩(wěn)定下調(diào)23kD肝再生增強(qiáng)因子表達(dá)的人腎小管上皮細(xì)胞株
　　目的：通過(guò)慢病毒感染人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）及嘌呤篩選的方法，構(gòu)建穩(wěn)定下調(diào)23kD肝再生增強(qiáng)因子（augmenter of liver regeneration，ALR）表達(dá)的人腎小管上皮細(xì)胞株。
　　方法：設(shè)計(jì)針對(duì)人ALR基因的siRNA干擾靶點(diǎn)序列，構(gòu)建特異性干擾人ALR表達(dá)的慢病毒shRNA/ALR，轉(zhuǎn)染人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）細(xì)胞。慢病

2、毒shRNA/control轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞作為對(duì)照。通過(guò)不同濃度嘌呤霉素對(duì)HK-2細(xì)胞進(jìn)行處理，確定嘌呤霉素的篩選濃度。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫印跡法檢測(cè)人腎小管上皮細(xì)胞中23kD ALR的表達(dá)情況。MTS檢測(cè)HK-2細(xì)胞的增殖能力。
　　結(jié)果：序列對(duì)比確認(rèn)慢病毒中ALR siRNA寡核苷酸序列插入正確，嘌呤篩選濃度確認(rèn)為3μg/ml。實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫印跡檢測(cè)顯示，與正常組及shRNA/control對(duì)照組比較，sh

3、RNA/ALR組細(xì)胞內(nèi)源性23kD ALR mRNA水平及蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.05）。MTS結(jié)果顯示，下調(diào)23kD ALR表達(dá)對(duì)HK-2細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響（P＞0.05）。
　　小結(jié)：成功構(gòu)建了穩(wěn)定下調(diào)23kD ALR表達(dá)的HK-2細(xì)胞株。
　　第二部分、I/R處理對(duì)HK-2細(xì)胞23kD ALR表達(dá)及自噬水平的影響
　　目的：了解體外缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）處理對(duì)HK-2細(xì)

4、胞23kD ALR表達(dá)及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　方法：采用無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基結(jié)合缺氧復(fù)氧的方法對(duì)HK-2細(xì)胞進(jìn)行處理。通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)HK-2細(xì)胞中23kD ALR表達(dá)變化及自噬相關(guān)蛋白LC3II及p62表達(dá)變化。免疫熒光觀察HK-2細(xì)胞中LC3熒光光點(diǎn)表達(dá)情況。
　　結(jié)果：免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)I/R處理后HK-2細(xì)胞內(nèi)23kD ALR表達(dá)升高，后逐漸降至正常。在I/R處理后3、6、12、24小時(shí)自噬相關(guān)蛋白LC3II表達(dá)

5、均明顯升高，自噬底物蛋白p62表達(dá)下降，免疫熒光結(jié)果提示I/R處理后HK-2細(xì)胞中LC3熒光明顯增強(qiáng)。
　　小結(jié)：在I/R過(guò)程中HK-2細(xì)胞ALR表達(dá)先升高，后恢復(fù)正常。HK-2細(xì)胞自噬水平先升高，后有所降低，但仍高于正常，體外I/R模型構(gòu)建成功。
　　第三部分、下調(diào)23kD ALR表達(dá)對(duì)缺血再灌注誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞自噬水平的影響
　　目的：探討下調(diào)23kD ALR表達(dá)對(duì)缺血再灌注誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞自噬水平的影響并探

6、討其作用機(jī)制。
　　方法：用無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基結(jié)合缺氧復(fù)氧的方法對(duì)HK-2細(xì)胞進(jìn)行處理，誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞自噬。慢病毒shRNA/ALR轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞下調(diào)了細(xì)胞中23kD ALR的表達(dá)。免疫印跡法檢測(cè)ALR及自噬相關(guān)蛋白LC3II，p62，p-AMPK，AMPK，p-mTOR，mTOR，凋亡蛋白caspase-3的變化情況。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)HK-2細(xì)胞LC3熒光的表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen，

7、ROS）水平。電鏡檢測(cè)HK-2細(xì)胞自噬小體的形成情況。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡水平。
　　結(jié)果：免疫印跡法檢測(cè)及熒光顯微鏡結(jié)果顯示，與shRNA/control對(duì)照組比較，shRAN/ALR組細(xì)胞自噬水平在I/R后明顯增高，細(xì)胞內(nèi)自噬小體增多，細(xì)胞ROS水平顯著增加。與shRNA/control組相比，shRNA/ALR組在缺血再灌注6小時(shí)（R6H）p-AMPK升高，p-mTOR降低。予以 AMPK抑制劑 Compound C對(duì)HK