芍藥苷在骨性關(guān)節(jié)炎中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種以軟骨細(xì)胞凋亡、軟骨基質(zhì)破壞、軟骨下骨骨化、骨贅形成及滑膜炎癥反應(yīng)為特征的綜合性慢性疾病，好發(fā)于中老年人，給我國(guó)的醫(yī)療及經(jīng)濟(jì)帶來(lái)巨大負(fù)擔(dān)。骨關(guān)節(jié)炎的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為軟骨基質(zhì)合成和降解的平衡失調(diào)，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)破壞是關(guān)節(jié)退化的主要原因。早期的治療主要包括口服非甾體類消炎藥及關(guān)節(jié)腔注射透明質(zhì)酸及激素，但這些手段只能緩解疼痛，病情易反復(fù)，并容易帶來(lái)消化系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)的副作用

2、。
　　芍藥苷(Paeoniflorin，PF)是從中藥白芍總苷中提取的單萜類糖苷化合物，來(lái)源于芍藥科植物芍藥根、牡丹根、紫牡丹根。由于其中藥單體成分明確，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外大量學(xué)者對(duì)其藥理藥效作用進(jìn)行了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)其具有擴(kuò)張血管、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、抗炎抗?jié)儭⒖棺杂苫趸瘬p傷、解熱解痙等作用。在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中，PF能下調(diào)炎性因子如白介素1、6、17及腫瘤壞死因子的表達(dá)，并上調(diào)抗炎因子TGF-β的水平，從而對(duì)RA起到治療作用。在脊柱

3、退變模型的實(shí)驗(yàn)中，研究者發(fā)現(xiàn)口飼一定劑量的芍藥苷能降低大鼠髓核細(xì)胞中Bax的含量，同時(shí)下調(diào)相關(guān)凋亡因子的表達(dá)，從而抑制髓核細(xì)胞的凋亡，對(duì)脊柱退行性改變起到保護(hù)作用。目前基于芍藥苷與軟骨細(xì)胞的研究探索比較少，我們想通過(guò)本研究，明確芍藥苷在骨性關(guān)節(jié)炎病理過(guò)程中，是否可以抑制軟骨細(xì)胞凋亡及軟骨基質(zhì)破壞，從而發(fā)揮關(guān)節(jié)保護(hù)作用。
　　本研究主要分三部分:一、首先通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠軟骨細(xì)胞，加入不同濃度的PF干預(yù)后，用白介素-1β進(jìn)行刺激，檢測(cè)

4、軟骨細(xì)胞中MMPs、TIMP-1基因及蛋白表達(dá)的差異，并進(jìn)一步通過(guò)分析檢測(cè)NF-κB通路的相關(guān)蛋白表達(dá)水平來(lái)明確PF作用機(jī)制。我們的研究表明一定濃度的PF能抑制IL-1β介導(dǎo)的MMPs分泌，并上調(diào)TIMP-1的表達(dá)，從而拮抗IL-1β介導(dǎo)的軟骨降解，并且該作用通過(guò)部分抑制NF-κB通路得以實(shí)現(xiàn)。二、在體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞中，觀察PF對(duì)IL-1β介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的影響。通過(guò)PF干預(yù)后，檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡率、凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)PF

5、能上調(diào)Bcl-2家族表達(dá)并抑制Bax表達(dá)，抑制Caspase-3活性，從而拮抗IL-1β介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。三、觀察在ACLT動(dòng)物模型中，關(guān)節(jié)腔注射PF對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一定濃度的PF可減輕關(guān)節(jié)軟骨損傷。我們的研究結(jié)果表明，PF很可能通過(guò)發(fā)揮抗炎及抗凋亡作用從而對(duì)關(guān)節(jié)軟骨起到保護(hù)作用。
　　第一部分 PF對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞中MMPs/TIMP-1表達(dá)的影響
　　目的:觀察PF對(duì)IL-1β介導(dǎo)軟骨細(xì)胞MMPs/TIMP-1

6、表達(dá)的影響及其分子機(jī)制。
　　方法:取4周齡SD大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織，用酶消化法行體外培養(yǎng)，傳代至3代穩(wěn)定后，MTT法檢測(cè)不同濃度PF對(duì)軟骨細(xì)胞活性影響，選取合適濃度范圍的PF用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。加入不同濃度的PF預(yù)處理3小時(shí)，之后再加入IL-1β10ng/ml培養(yǎng)24小時(shí)，用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)MMP-1，MMP-3，MMP-13及TIMP-1的基因表達(dá)，western blot檢測(cè)MMP-1，MMP-3，MMP-13，TIMP-1、核

7、轉(zhuǎn)錄因子p65亞基和轉(zhuǎn)錄抑制因子(Inhibitor of nuclear factor kappa B，IκB-α)的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:PF能抑制IL-1β介導(dǎo)的MMPs基因及蛋白表達(dá)，并上調(diào)軟骨細(xì)胞中的TIMP-1水平。同時(shí)PF能抑制IL-1β介導(dǎo)的IκB-α降解和NF-κB磷酸化。
　　結(jié)論:PF可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路拮抗IL-1β介導(dǎo)的MMPs基因及蛋白表達(dá)，并上調(diào)TIMP-1水平。
　　第二部分 P

8、F對(duì)IL-1β介導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞凋亡的影響
　　目的:觀察PF對(duì)IL-1β介導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞凋亡的影響及其分子機(jī)制探討。
　　方法:體外培養(yǎng)SD大鼠軟骨細(xì)胞，待細(xì)胞活性穩(wěn)定后，用不同濃度PF預(yù)處理3小時(shí)，之后加入IL-1β10ng/ml培養(yǎng)24小時(shí)，通過(guò)乳酸脫氫酶活性檢測(cè)及流式細(xì)胞檢測(cè)明確PF對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的作用，Caspase-3活性試劑盒檢測(cè)Caspase-3活性，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)Bcl-2及Bax基因表達(dá)，West

9、ern blot檢測(cè)Bcl-2，Bax，總Akt和磷酸化Akt的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:PF能通過(guò)上調(diào)Akt磷酸化，拮抗IL-1β介導(dǎo)的LDH釋放及抑制軟骨細(xì)胞的凋亡，并上調(diào)Bcl-2表達(dá)，抑制Bax表達(dá)及Caspase-3活性。
　　結(jié)論:PF能抑制IL-1β介導(dǎo)的LDH釋放，透過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)PF能拮抗IL-1β介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步的分析表明PF能通過(guò)上調(diào)Bcl-2基因及蛋白表達(dá)，并下調(diào)Bax水平，同時(shí)降低Caspas

10、e-3的活性來(lái)發(fā)揮凋亡作用。該作用與Akt通路密切相關(guān)。
　　第三部分 PF對(duì)兔OA模型的保護(hù)作用
　　目的:通過(guò)建立動(dòng)物模型進(jìn)一步觀察驗(yàn)證PF對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的保護(hù)作用。
　　方法:32只新西蘭兔均分為正常組、空白組、低劑量PF組及高劑量PF組。后三組共24只行單側(cè)前交叉韌帶離斷法制作OA模型。建模4周后，分別予0.3mlDMSO、0.3ml低劑量PF（25μM）及0.3ml高劑量PF(50μM)注射，每周一次，持續(xù)5周。