FGFR3在骨性關節(jié)炎發(fā)生和發(fā)展中的作用和機制研究.pdf

1、骨性關節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是一種在老年人中常見的退行性關節(jié)病變,是導致老年人行走不便的最主要疾病。骨性關節(jié)炎為關節(jié)慢性進行性病變,多累及負重關節(jié),臨床上以關節(jié)疼痛、關節(jié)活動受限、關節(jié)畸形為特點。目前國內外對OA的研究雖然較多,但是仍然缺乏有效安全防治骨性關節(jié)炎的藥物。研究早期影響骨性關節(jié)炎進展的分子機制,有利于尋找延緩關節(jié)炎進展的藥物,研發(fā)早期治療措施。
　　FGFR3(Fibroblast growth f

2、actor receptor3,FGFR3)屬于成纖維細胞生長因子受體家族,為酪氨酸激酶受體,其配體為成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factors, FGFs)。在23種FGFs中,FGF9和FGF18是FGFR3的相對特異性配體。FGFR3除了在骨骼發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用外,其在關節(jié)軟骨的發(fā)育以及關節(jié)軟骨細胞穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮重要作用。FGFR3敲除小鼠會出現骨性關節(jié)炎的表型,其關節(jié)軟骨中MMP13的表達升高,提

3、示FGFR3對關節(jié)軟骨起保護作用,但是FGFR3敲除小鼠出現OA表型并沒有排除其骨骼畸形的力學影響。FGF9是FGFR3的相對特異性配體,在小鼠中FGF9突變會導致肘關節(jié)和膝關節(jié)的骨性聯結綜合征(Elbow knee synostosis, EKS),在人可引起多發(fā)性骨性連接綜合征(Multiple synostosis syndrome, SYNS),EKS和SYNS的重要特點就是小鼠或者患者出現關節(jié)融合等癥狀。這些結果提示FGFR3

4、在骨關節(jié)炎發(fā)生過程中起重要作用,但FGFR3調節(jié)軟骨修復的具體機制尚不明確。
　　為了進一步探討FGFR3在骨性關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中的作用和機制,我們使用FGFR3軟骨特異性誘導敲除和持續(xù)激活小鼠,來探索FGFR3在關節(jié)炎發(fā)生和發(fā)展過程中對關節(jié)軟骨修復過程的影響。
　　實驗方法:
　　1、建立三種小鼠模型,其中Fgfr3G369C/+小鼠為FGFR3增強型點突變小鼠(模擬人的ACH疾病,稱為ACH小鼠),Col2a1-Cr

5、eERT2;Fgfr3flox/flox小鼠為FGFR3軟骨特異性誘導敲除小鼠(Fgfr3 conditional induced knock out,簡稱為Fgfr3 cKO小鼠), Col2a1-CreERT2;Fgfr3+/K644Eneo小鼠為 FGFR3軟骨異性誘導持續(xù)激活小鼠( Fgfr3 conditonal induced activation,簡稱為Fgfr3 cActivation小鼠)。PCR鑒定小鼠基因型。在Fg

6、fr3 cKO小鼠和Fgfr3 cActivation小鼠2月齡時腹腔注射Tamoxifen,連續(xù)注射5天,使小鼠在成年期軟骨中敲除或激活FGFR3;
　　2、建立小鼠關節(jié)炎模型,即老年自發(fā) OA模型和 DMM(Destablilization of the medial meniscus)手術誘導的OA模型。DMM手術即顯微手術挑斷內側半月板脛骨韌帶,造成小鼠內側半月板不穩(wěn)定而關節(jié)軟骨磨損形成OA。在Fgfr3 cKO小鼠和Fg

7、fr3 cActivation小鼠注射完Tamoxifen后行DMM手術。
　　3、ACH小鼠在12月和20月齡時取材,Fgfr3 cKO和Fgfr3 cActivation小鼠分別在3月齡和4月齡時取材。使用X光觀察Fgfr3 cKO小鼠4月齡時體長和關節(jié)大體情況。制備以上小鼠標本的組織切片。使用藏紅固綠染色觀察關節(jié)軟骨情況,并參考OARSI(Osteoarthrisits Research Society Internatio

8、nal)推薦方法對ACH小鼠、Fgfr3 cKO和Fgfr3 cActivation小鼠的關節(jié)軟骨基質丟失和損傷情況進行評分。使用免疫組化染色觀察關節(jié)軟骨Col II、Collagen X以及MMP13的表達,在Fgfr3 cKO小鼠關節(jié)軟骨中觀察FGFR1的表達。
　　4、體外培養(yǎng)Fgfr3 cKO小鼠原代關節(jié)軟骨細胞,用4-hydroxyTamoxifen處理,在原代軟骨細胞中敲除Fgfr3,然后利用實時熒光定量PCR檢測Mm

9、p13、Collagen X、Collagen II、Adamts-5、Ihh的表達。
　　5、通過轉染實驗使 ATDC5細胞過表達 Fgfr3,利用實時熒光定量 PCR檢測Mmp13、Collagen X的表達。
　　主要實驗結果:
　　1、Fgfr3 cKO小鼠關節(jié)軟骨發(fā)生異常肥大化并在DMM手術后關節(jié)損傷加重。
　　(1) Fgfr3 cKO小鼠骨骼大體發(fā)育正常;
　　(2) Fgfr3 cKO小鼠關

10、節(jié)軟骨肥大化并在DMM手術后1月后關節(jié)軟骨損傷加重;
　　(3) Fgfr3 cKO小鼠關節(jié)軟骨MMP13、Collagen X表達升高而Collagen II表達降低;
　　(4) Fgfr3 cKO小鼠關節(jié)軟骨FGFR3表達降低而FGFR1表達增高;
　　(5) Fgfr3cKO小鼠原代軟骨細胞Mmp13、Collagen X、Adatms-5和Ihh表達上調
　　2、老年自發(fā)骨關節(jié)炎模型中 ACH小鼠關節(jié)軟

11、骨細胞外基質降解延遲,并且其MMP13、Collagen X表達降低。
　　3、Fgfr3cActivation小鼠關節(jié)軟骨在 DMM手術后關節(jié)軟骨損傷過程延遲發(fā)生。DMM術后Fgfr3 cActivation小鼠關節(jié)軟骨MMP13和Collagen X表達降低而Collagen II表達升高。
　　4、ATDC5細胞中過表達Fgfr3導致Mmp13、Collagen X表達下調。
　　主要結論:
　　通過上述分