胰島素受體親合短肽的篩選、合成及量子點(diǎn)熒光標(biāo)記的研究.pdf

1、本研究以高效表達(dá)胰島素受體的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)作為篩選靶,利用噬菌體隨機(jī)展示六肽庫(kù)篩選胰島素受體親和短肽.經(jīng)四輪篩選,得到六個(gè)ELISA陽(yáng)性重組克隆,測(cè)定其Kd值均為納摩爾級(jí)(5.911nM~26.899nM).Kd值作為篩選成功的主要指標(biāo)能更真實(shí)反映篩選效果.經(jīng)測(cè)序得到六個(gè)肽序列,比較發(fā)現(xiàn)明顯的保守序列存在.通過(guò)肽自動(dòng)合成儀和手工合成其中五個(gè)小肽,又以肽偶聯(lián)方式將生物素連接在短肽N-末端,得到小肽的生物素化和形式.以質(zhì)譜和EL

2、ISA方法從結(jié)構(gòu)和生物活性?xún)煞矫孀C明以此方法連接的生物素不影響其與親合素的結(jié)合活性.此方法簡(jiǎn)化了常規(guī)使用NHS-biotin進(jìn)行短肽生物素化后的繁雜純化過(guò)程,而且大大降低了原料花費(fèi).ELISA方法測(cè)定并利用PRISM 4.0軟件計(jì)算了這五個(gè)小肽與CHO-IR的Kd值,在5.870 μ M~128.6 μ M之間,屬于特異性結(jié)合范圍.比較其與噬菌體展示短肽與CHO-IR的Kd值的差異,在102-104之間.因?yàn)樵陔膸?kù)的篩選和檢測(cè)中所用的單

3、抗—多抗系統(tǒng)經(jīng)歷了兩步信號(hào)放大,而且噬菌體展示表位肽附近的氨基酸在空間上可能對(duì)結(jié)合有貢獻(xiàn),由此產(chǎn)生了這種差異.這一比較結(jié)果可以為以后肽庫(kù)篩選的取舍提供參考.發(fā)光量子點(diǎn)(luminescent quantum dot)又可稱(chēng)為半導(dǎo)體納米微晶體(semiconductornanocrystal),是近幾年發(fā)展起來(lái)的新材料,是由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素組成的納米顆粒.作為熒光探針,量子點(diǎn)越來(lái)越顯示出它能夠替代傳統(tǒng)的有機(jī)染料優(yōu)越性.量子點(diǎn)具有狹窄

4、對(duì)稱(chēng)的熒光譜峰(通常20nm~30nm).而且可以根據(jù)量子點(diǎn)的大小和組成材料調(diào)整它的發(fā)射光譜,以CdTe納米晶體合成為例,當(dāng)它的微粒尺寸(直徑)從2.5nm生長(zhǎng)到4.0 nm時(shí),它們的光譜即可以從520nm調(diào)整到650nm.量子點(diǎn)具有寬泛的吸收光譜,這樣就能用同一光譜同時(shí)激發(fā)所有顏色的QDs.此外,量子點(diǎn)的熒光信號(hào)強(qiáng)而穩(wěn)定,不易被光漂白,不影響生物分子(抗體、蛋白、細(xì)胞)的生物活性.以上種種都使量子點(diǎn)成為一種新型的潛力巨大的熒光探針,應(yīng)