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文檔簡介
1、內(nèi)肥素(visfatin)是一種新發(fā)現(xiàn)的具有結合并激活胰島素受體,模擬胰島素作用的肽類激素。內(nèi)肥素有多種生物學效應,在體內(nèi)和體外實驗中具有類胰島素作用,導致其自發(fā)現(xiàn)以來成為內(nèi)分泌研究領域的又一研究熱點。內(nèi)肥素能結合并激活胰島素受體,但與胰島素在胰島素受體的結合部位上存在差異。目前其確切生理作用和在胰島素受體上的具體結合域并不十分清楚,是否存在其自身的特異性受體尚有待于進一步研究。 為獲得大量高純度重組內(nèi)肥素,本實驗首先構建內(nèi)肥
2、素的高效表達系統(tǒng)。本實驗采用Trizol法自人大網(wǎng)膜脂肪組織中提取內(nèi)臟脂肪組織總RNA,并以之為模板通過RT-PCR的方法擴增人內(nèi)肥素成熟肽編碼基因。將該基因克隆入pGM-T載體,并進行DNA序列分析。在此基礎上,將編碼人內(nèi)肥素的基因片段克隆到表達載體pQE-30Xa上,并轉化入E.coliM15[pREP4],進行融合表達。目的蛋白含6×His純化標簽,可以經(jīng)金屬螯合親和層析吸附于Ni-NTA樹脂層析柱,梯度增加沖洗液中咪唑濃度以除去
3、非特異吸附的雜蛋白后,最終將目的蛋白洗脫,超濾離心法濃縮并初步純化蛋白。隨后經(jīng)Xa因子酶切處理,去除融合標簽,將融合標簽經(jīng)金屬螯合親和層析吸附于Ni-NTA樹脂層析柱。表達的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot鑒定無誤。蛋白表達條件經(jīng)優(yōu)化后,重組蛋白占菌體總蛋白的42.634%,內(nèi)肥素的表達量達到300mg/L培養(yǎng)基,屬于高效表達,成功構建了內(nèi)肥素的高效原核表達系統(tǒng)。目的蛋白只含有內(nèi)肥素成熟肽序列,最終經(jīng)純化后的內(nèi)肥素純度
4、為95.629%。通過蛋白質一蛋白質相互作用測定內(nèi)肥素與胰島素受體的結合活性,證明實驗得到的表達產(chǎn)物內(nèi)肥素能與胰島素受體結合,具有生物活性,并具備一定的劑量依賴關系。 為研究與內(nèi)肥素結合的多肽序列,將純化后的內(nèi)肥素包被于培養(yǎng)平皿上,通過噬菌體展示技術對噬菌體隨機七肽文庫進行三輪淘選后,表面展示有與內(nèi)肥素能發(fā)生特異性結合的多肽序列的噬菌體被富集。富集后的噬菌體最后被洗脫下來,隨機對其中24個陽性克隆進行DNA序列分析,根據(jù)DNA
5、序列分析的結果,推斷出與內(nèi)肥素特異性結合的多肽模序。隨后通過ELISA證實,所有經(jīng)淘選獲得的序列均能與內(nèi)肥素發(fā)生特異性結合,且隨噬菌體滴度的下降,在410nm的吸光度呈一定的梯度下降。根據(jù)對24個噬菌體DNA測序結果的比較,發(fā)現(xiàn)在這些序列中,AAKTPTE、ATTVPAS以及MSLQQEH短肽出現(xiàn)的頻率最高,分別有8個、4個和4個克隆。通過對已測序的結果進行分析,可以發(fā)現(xiàn)AA(X)TPT(X)這個序列的出現(xiàn)的頻率很高,這個序列很可能就是
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