小地老虎性信息素合成激活肽受體(PBANR)的克隆、表達(dá)及RNAi研究.pdf

1、小地老虎 Agrotis ipsilon是一種破壞力很強(qiáng)的遷飛性鱗翅目害蟲(chóng)，危害世界范圍內(nèi)的多種作物。性信息素合成激活肽受體（PBANR），調(diào)節(jié)多種鱗翅目昆蟲(chóng)性信息素的合成。能夠與調(diào)控性信息素合成中扮演重要角色的GPCRs結(jié)合。在鱗翅目成蟲(chóng)中，交配能夠引起雌蟲(chóng)短時(shí)間終止性信息素的產(chǎn)生。本文通過(guò)RACE-PCR方法，從小地老虎雌蟲(chóng)性腺中克隆獲得小地老虎PBANR全長(zhǎng)基因，命名為Aips-PBANR，該基因由3539個(gè)堿基組成。蛋白序列比對(duì)

2、表明，Aips-PBANR與鱗翅目其他昆蟲(chóng)的PBANR具有較高的序列一致性。利用RT-PCR方法，從小地老虎雌蟲(chóng)性腺和雄蟲(chóng)生殖器中均檢測(cè)到 Aips-PBANR基因的表達(dá)。qRT-PCR該基因在成蟲(chóng)不同組織和日齡的表達(dá)特征進(jìn)行研究。結(jié)果表明，Aips-PBANR在雌蟲(chóng)性腺中的表達(dá)量最高，在雄蟲(chóng)的生殖器中也檢測(cè)到較低的表達(dá)；羽化后第四天上午2:00基因表達(dá)量最高；另外，qRT-PCR結(jié)果表明，交配能夠明顯抑制 Aips-PBANR基因的表

3、達(dá)，因此進(jìn)一步證明交配能夠抑制昆蟲(chóng)性信息素的產(chǎn)生。
　　RNA干擾技術(shù)（RNAi）作為害蟲(chóng)防治的新方法具有很大的應(yīng)用潛力。然而，在不同昆蟲(chóng)之間RNAi干擾效率存在很大差異。其中，鱗翅目是最難應(yīng)用RNAi技術(shù)的昆蟲(chóng)。本文以小地老虎 Aips-PBANR基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)分別注射 dsRNA和 siRNA的方法干擾Aips-PBANR基因在雌蟲(chóng)中的表達(dá)。對(duì)8~9日齡雌蟲(chóng)腹部分別注射20μl siRNA、dsRNA、dsGFP和水，7

4、2小時(shí)后通過(guò)qRT-PCR方法檢測(cè)沉默效率。結(jié)果表明，注射siRNA的試驗(yàn)組， PBANR基因mRNA表達(dá)量下調(diào)90％以上，注射dsRNA的試驗(yàn)組下調(diào)56%，下調(diào)水平均顯著高于注射dsGFP、水以及未注射的對(duì)照組。
　　小地老虎在時(shí)間和空間維度上具有令人驚訝的個(gè)體生長(zhǎng)，種群存活以及繁殖能力。幼蟲(chóng)的爆發(fā)與遷飛成蟲(chóng)經(jīng)歷的溫度密切相關(guān)。然而與種群爆發(fā)及遷飛相關(guān)的機(jī)制目前尚不清楚。本文還在室內(nèi)研究了不同溫度范圍（16–36℃）對(duì)小地老虎交

5、配、產(chǎn)卵以及壽命的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，在24–28℃范圍內(nèi)，成蟲(chóng)的交配率與交配頻率最高，超出該范圍交配率與交配頻率降低；高溫條件下，成蟲(chóng)夜間交配起始時(shí)間延遲，隨著溫度增加，交配持續(xù)時(shí)間降低，同時(shí)，產(chǎn)卵前期和產(chǎn)卵期逐漸下降；高峰日和繁殖力最高，并隨著溫度降低呈下降趨勢(shì)。另外，溫度與成蟲(chóng)壽命關(guān)系表明，成蟲(chóng)壽命與溫度呈負(fù)相關(guān)；低溫條件下雄蟲(chóng)的壽命高于雌蟲(chóng)；32–36℃，雌蟲(chóng)壽命高于雄蟲(chóng)。因此，認(rèn)為24–28℃是小地老虎繁殖產(chǎn)卵的最佳溫度范圍，

6、幼蟲(chóng)危害或爆發(fā)可能發(fā)生在溫度范圍在24–28℃的區(qū)域，這將為預(yù)測(cè)種群爆發(fā)的區(qū)域范圍提供重要依據(jù)。
　　本文首次從小地老虎雌蟲(chóng)性腺克隆獲得了 Aips-PBANR基因。定量研究了該基因轉(zhuǎn)錄本在小地老虎不同組織、日齡及交配前后的表達(dá)變化。通過(guò)雌蟲(chóng)腹部注射siRNA和dsRNA的方法對(duì) Aips-PBANR基因進(jìn)行沉默。這些研究結(jié)果為幫助干擾生殖功能作為害蟲(chóng)管理方法以及理解神經(jīng)肽受體多樣化功能提供可靠的基礎(chǔ)。另外，明確不同溫度對(duì)小地老虎