重組人過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ——胰高血糖素樣肽-1的克隆、表達(dá)及純化.pdf

1、背景:過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)屬于核受體超家族中PPARs家族成員，為配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子。PPARγ配體包括天然型配體和合成型配體，其中合成型配體噻唑烷二酮(thiazolidinediones，TZD)類藥物可選擇性的與PPARγ結(jié)合，TZD類藥物能夠增加骨骼肌中葡萄糖的利用，并降低體內(nèi)肝臟的葡萄糖合成。有研究表明，PPARγ功能受損會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的胰島素抵抗。
　　 胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是胰島α細(xì)胞

2、和腸黏膜L細(xì)胞分泌的一種激素，含有30個(gè)氨基酸，經(jīng)胰高糖素原加工，其N端形成胰高糖素，C端形成GLP-1和GLP-2。GLP-1的活性形式是GLP-1(7-36)，可以促進(jìn)葡萄糖依賴性的胰島素分泌、減少食物的攝取、減慢胃的排空、以及抑制胰高血糖素的分泌、刺激胰島β細(xì)胞增殖，促進(jìn)胰島再生，又能抑制胰島β細(xì)胞的凋亡。目前已有研究證明PPARγ和GLP-1在糖尿病治療中的作用，然而有無(wú)既可恢復(fù)胰島素敏感性又能促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖藥物的研究，尚未

3、見(jiàn)有關(guān)報(bào)道。
　　 目的:本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建含人過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ-胰高血糖素樣肽-1的原核表達(dá)載體(pET32a-PPARγ-GLP-1)，通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)，獲得大量融合蛋白，為進(jìn)一步檢測(cè)其生物活性提供研究基礎(chǔ)。
　　 方法:從人脂肪中提取總RNA通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增出人PPARγ基因序列，從人外周血有核細(xì)胞中提取人類基因組DNA，PCR擴(kuò)增獲得GLP-1基因序列，通過(guò)基因重組技術(shù)構(gòu)建pET32a-PPARγ-G

4、LP-1，經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆;轉(zhuǎn)化入Rosseta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)10％SDS-PAGE凝膠電泳，并做Western boltting鑒定。融合蛋白經(jīng)鎳離子層析純化。
　　 結(jié)果:1.成功構(gòu)建pET32a-PPARγ-GLP-1表達(dá)載體，經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定。2.10％SDS-PAGE結(jié)果表明，目的基因在大腸桿菌Rosseta(DE3)中以包涵體形式表達(dá)，相對(duì)分子量(Mr)73kDa。

5、3.經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化，在37℃，誘導(dǎo)劑IPTG濃度為1mmol/L，誘導(dǎo)10h，可獲得大量PPARγ-GLP-1融合蛋白。4.經(jīng)Ni-NTA純化獲得較高濃度融合蛋白。5.Western blotting顯示目的蛋白能被anti-his標(biāo)簽抗體識(shí)別，再次證實(shí)目的蛋白成功表達(dá)。
　　 結(jié)論:本研究證實(shí)可以成功構(gòu)建pET32a-PPARγ-GLP-1重組質(zhì)粒，且目的基因可在大腸桿菌Rosseta(DE3)原核表達(dá)系統(tǒng)中以包涵體形式高