過氧化物酶體增殖物激活受體γ在COPD大鼠肺部慢性炎癥中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：
　　為了探討PPARγ在COPD發(fā)生機(jī)制中的作用，本課題擬從活體和離體水平研究PPARγ在香煙所致的肺部慢性炎癥中的表達(dá)變化，并應(yīng)用PPARγ天然配體15-脫氧前列腺素J2(15-deoxy-Delta12，14-prostaglandin J2，15d-PGJ2)和合成配體羅格列酮激活PPARγ，觀察其表達(dá)與炎癥反應(yīng)的關(guān)系。為了進(jìn)一步探索PPARγ的具體作用機(jī)制，本研究通過配體激活PPARγ，觀察其對香煙所致的TLR2、

2、TLR4表達(dá)及NF-κB、ERK活化的影響。為了闡明PPARγ兩種配體是通過活化PPARγ來起作用的，實(shí)驗(yàn)還觀察了PPARγ特異性抑制劑雙酚A型環(huán)氧樹脂（bisphenol A diglycide ether，BADGE）是否能夠逆轉(zhuǎn)15d-PGJ2和羅格列酮的作用。上述研究將有助于提高對COPD發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，為探索治療COPD的新的靶點(diǎn)提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)分為體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)兩部分，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)主要是通

3、過觀察COPD大鼠肺組織中PPARγ表達(dá)及羅格列酮對肺部形態(tài)學(xué)和炎癥介質(zhì)的影響，來探索PPARγ在香煙所致的肺部慢性炎癥中的作用;體外實(shí)驗(yàn)是在原代肺泡巨噬細(xì)胞(alveolarmacrophages，AMs)和人支氣管上皮細(xì)胞系(Human Bronchial Epithelial Cells，16HBE)細(xì)胞中觀察15d-PGJ2和羅格列酮對香煙誘導(dǎo)的TLR2、TLR4表達(dá)及NF-κB、ERK活化的影響，以進(jìn)一步探討PPARγ的具體作

4、用機(jī)制。
　　1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分
　　(1)動物分組和COPD模型的制備:健康雄性Wistar大鼠40只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組、COPD模型組、羅格列酮組和羅格列酮+BADGE組(RB組)，每組10只。模型組、羅格列酮組和RB組大鼠用自制熏煙箱每天吸煙2次，每次16支香煙，熏煙12周，ROSI組大鼠在每天吸煙前30分鐘用羅格列酮(30mg/kg)灌胃1次，RB組大鼠在每天吸煙前30分鐘分別用羅格列酮(30mg/kg)灌

5、胃和BADGE(30mg/kg)腹腔注射1次。正常對照組吸入室內(nèi)空氣。
　　(2)肺功能的測定:煙熏結(jié)束后第2日，模型組大鼠行小動物肺功能檢測以明確氣流受限程度。
　　(3)病理標(biāo)本的制備及形態(tài)定量分析:取每只大鼠的右下葉肺組織，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色。對HE染色標(biāo)本進(jìn)行氣道炎癥及肺實(shí)質(zhì)病理評分、每視野的平均肺泡數(shù)和平均肺泡直徑的測定。
　　(4)炎癥介質(zhì)與細(xì)胞因子檢測:酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linke

6、dimmunosorbent assay，ELISA)檢測各組大鼠BALF、肺組織勻漿及血清中炎性介質(zhì)LTB4和細(xì)胞因子IL-8的含量。
　　(5)BALF液中細(xì)胞分?jǐn)?shù):BALF沉渣甩片，常規(guī)HE染色，行淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肺泡巨嗜細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　(6)免疫組化染色:采用SABC(Strept Actividin-Biotin Complex)法，對石蠟包埋標(biāo)本行TLR2、TLR4和PPARγ相對含量的測定。
　　(

7、7)RNA提取及實(shí)時定量PCR(Realtime-PCR)擴(kuò)增:大鼠處死后，剖胸取右中上肺組織50mg，液氮速凍，按RNA提取試劑盒操作說明進(jìn)行總RNA的提取，擴(kuò)增TLR2、4和PPARγ CDNA序列。
　　2、體外實(shí)驗(yàn)部分
　　(1)純化肺泡巨嗜細(xì)胞:各組大鼠處死后，夾閉其右主支氣管，向氣管緩慢注入生理鹽水4毫升灌洗左肺，反復(fù)3次，體外培養(yǎng)2小時以獲得純化的AMs。
　　(2)提前2小時給與5μm15d-PGJ2、

8、50μm羅格列酮、5μm15d-PGJ2+100μmBADGE及50μm羅格列酮+100μm BADGE處理正常AMs或16HBE，再用1％、5％的香煙煙霧提取物（cigarette smoke extrat，CSE）刺激細(xì)胞。
　　(3)5μm15d-PGJ2、50μm羅格列酮、5μm15d-PGJ2+100μm BADGE及50μm羅格列酮+100μm BADGE預(yù)處理AMs及16HBE，應(yīng)用RT-PCR、western bl

9、ot及流式檢測其對1％CSE誘導(dǎo)的TLR2和TLR4表達(dá)變化的影響，以明確PPARγ對TLR的調(diào)控作用。
　　(4)16HBE給予NF-κB的阻斷劑PDTC和ERK阻斷劑PD98059后，RT-PCR、western blot及流式檢測阻滯劑對15d-PGJ2和羅格列酮所致TLR表達(dá)變化的影響，來探討PPAR-γ對TLR的具體調(diào)控機(jī)理。
　　結(jié)果：
　　1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　(1)肺功能檢測:與正常對照組比較，模型組

10、大鼠FEV0.3/FVC×100％、PEF明顯下降（P均＜0.01），說明存在明顯氣流受限。
　　(2)肺組織形態(tài)學(xué)測量結(jié)果
　　與對照組相比，模型組大鼠肺體積增大，表面不平。光鏡下可見支氣管黏膜上皮脫落，管壁及周圍大量的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，杯狀上皮細(xì)胞增生肥大，氣道腔內(nèi)炎細(xì)胞滲出;肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁變薄或斷裂，肺泡呈囊狀擴(kuò)張，部分融合成肺大皰，符合COPD肺部病理形態(tài)學(xué)改變。結(jié)合上述肺功能結(jié)果，說明COPD模型復(fù)制成

11、功。
　　(3)BALF及肺組織勻漿中LTB4和IL-8的含量
　　與對照組比較，模型組大鼠BALF及肺組織勻漿中LTB4及IL-8含量均明顯增高（P均＜0.05）。與模型組比較，羅格列酮組BALF及肺組織勻漿LTB4和IL-8含量減少（P均＜0.05）。
　　(4)PPARγ的表達(dá)水平
　　免疫組化和real-time PCR結(jié)果顯示:與正常對照組比較，模型組肺泡上皮細(xì)胞及氣道上皮細(xì)胞的PPAR-γ表達(dá)下降(p

12、＜0.00)。與模型組對比，羅格列酮組和RB組PPAR-γ mRNA和蛋白表達(dá)顯著增高（p均＜0.01），但RB組PPAR-γ表達(dá)低于羅格列酮組(p＜0.05)。
　　(5)TLR2、TLR4的表達(dá)水平
　　免疫組化和real-time PCR結(jié)果顯示:與正常對照組比較，模型組肺泡上皮細(xì)胞及氣道上皮細(xì)胞的TLR2和TLR4表達(dá)增加（p均＜0.05）。與模型組對比，羅格列酮組和RB組TLR2和TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)顯著減

13、少（p均＜0.05）。
　　2、體外實(shí)驗(yàn)部分
　　(1)AMs功能及AMs和16HBE代謝活性
　　與正常對照組比較，模型組AMs吞噬功能顯著下降(p＜0.05)。與模型組比較，羅格列酮組AMs吞噬能力有所改善(p＜0.01)。與模型組相比，RB組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。1％CSE刺激各組AMs18小時后，與正常對照組比較，模型組AMs吞噬能力明顯下降（p均＜0.01）。與模型組比較，羅格列酮組AMs吞噬能力

14、增加(p均＜0.05)。與模型組相比，RB組AMs吞噬能力差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。
　　(2)AMs培養(yǎng)液上清及16HBE中LTB4含量
　　與正常細(xì)胞對比，5％CSE刺激后的AMs培養(yǎng)液上清中和16HBE中LTB4含量明顯增高（p均＜0.05）。與單純5％CSE刺激比較，提前給與15d-PGj2或羅格列酮可使培養(yǎng)液和16HBE中的LTB4含量減少（p均＜0.05）。與單純5％CSE刺激比較，15d-PGj2+ B

15、ADGE作用后培養(yǎng)液和16HBE中的LTB4含量減少（p均＜0.05)，但較單獨(dú)15d-PGj2處理，16HBE中的LTB4有所增加(p＜0.05)。與單純5％CSE刺激比較，羅格列酮+BADGE作用后的培養(yǎng)液和16HBE中LTB4含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　(3)PPARγ在AMs及16HBE中的表達(dá)
　　與正常對照組比較，模型組AMs的PPARγ顯著下降(p＜0.05)。與模型組比較，羅格列酮組和RB組A

16、Ms中PPAR-γ mRNA和蛋白表達(dá)顯著增高（p均＜0.05），但RB組PPAR-γ表達(dá)低于羅格列酮組(p＜0.05)。
　　(4)TLR2和TLR4在AMs及16HBE中的表達(dá)
　　與正常對照組比較，模型組AMs中TLR2和TLR4表達(dá)增加。與模型組對比，羅格列酮組和RB組AMs中TLR2和TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)顯著減少（p均＜0.05），但RB組TLR2和TLR4表達(dá)高于羅格列酮組（p均＜0.05）。
　　

17、結(jié)論：
　　1、PPARγ與肺部慢性炎癥有關(guān)，PPARγ表達(dá)異?？赡苁荂OPD發(fā)病原因之一。
　　2、活化PPARγ可顯著減輕香煙所致的氣道慢性炎癥，減少CSE誘導(dǎo)的AMs和16HBE細(xì)胞中的NF-κB活化及LTB4的增加，在一定程度上阻止了炎癥進(jìn)一步發(fā)展。
　　3、COPD模型中肺組織和AMs中的TLR2和TLR4表達(dá)逐漸增加，并伴隨著炎性指標(biāo)的逐漸增高，提示了TLR2和TLR4可能介導(dǎo)了香煙煙霧所致的AMs和氣道上