褐藻糖膠對(duì)小鼠乳腺癌的體內(nèi)外抵制作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的:褐藻糖膠(fucoidan)是從海帶中提取純化的一種多糖,其主要組成為褐藻糖、硫酸根,以及少量糖醛酸、半乳糖、木糖。褐藻糖膠具有抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、降血脂、降血糖、增強(qiáng)免疫力等生物學(xué)功能,使之成為天然海洋藥物研究的熱點(diǎn)。研究證實(shí),褐藻糖膠對(duì)腸癌、乳腺癌、肝癌和白血病等均有明顯的抑制作用,并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒副作用,但對(duì)其具體的作用機(jī)制尚未闡明。本研究以小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1為靶細(xì)胞,采用體外培養(yǎng)細(xì)胞(體外實(shí)驗(yàn)

2、)及建立荷瘤小鼠模型(體內(nèi)實(shí)驗(yàn))方法從分子水平、細(xì)胞水平及動(dòng)物整體水平探討褐藻糖膠的抗腫瘤活性及其作用機(jī)制,為最終將該藥開(kāi)發(fā)成為一種新型的天然抗癌藥物奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:1.體外實(shí)驗(yàn):體外培養(yǎng)小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1,采用MTT比色法、熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)(flowcytomary,FCM)、RT-PCR、Westernblotting等方法,觀察不同濃度褐藻糖膠對(duì)4T1細(xì)胞增殖和凋亡的影響,探討褐藻糖膠體外的抗腫瘤活性及其作用

3、機(jī)制。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):培養(yǎng)4T1細(xì)胞接種Balb/c小鼠建立荷瘤小鼠模型,觀察褐藻糖膠對(duì)荷瘤小鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制情況,TUNEL染色檢測(cè)瘤組織凋亡細(xì)胞,Westernblot及免疫組化等方法檢測(cè)褐藻糖膠處理后瘤組織內(nèi)Bcl-2/Bax、生存素(Survivin)、β連環(huán)蛋白(β-catinin)、細(xì)胞周期蛋白Cyclin-D1和細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶CDK4以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等相關(guān)蛋白的表達(dá),探討褐藻糖膠體內(nèi)的抗腫瘤活性

4、及其作用機(jī)制。
　　 結(jié)果:1.體外實(shí)驗(yàn):褐藻糖膠(0、50、100、200μg/ml)作用4T1細(xì)胞48h后,在熒光顯微鏡下觀察到褐藻糖膠處理組細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變:細(xì)胞核固縮、有DNA碎片;RT-PCR及Westernblot結(jié)果顯示,隨褐藻糖膠濃度的增加,Bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)均下降、BaxmRNA和蛋白表達(dá)升高,導(dǎo)致Bcl-2/Bax比值下降;凋亡抑制蛋白Survivin表達(dá)增加;線粒體膜電位下降,細(xì)胞色素

5、C由線粒體向細(xì)胞漿釋放增加,Caspase-3的活化率逐漸增加,明顯高于對(duì)照組(P＜0.05):MTT比色結(jié)果顯示褐藻糖膠能抑制4T1細(xì)胞增殖;細(xì)胞周期分析表明,經(jīng)50、100、200μg/ml褐藻糖膠處理48h后,G1期4T1細(xì)胞數(shù)明顯增加,呈明顯的G1期阻滯;Westernblot結(jié)果顯示隨褐藻糖膠濃度增加,β-catinin、CyclinD1和細(xì)胞周期依賴激酶CDK4表達(dá)逐漸減少(P＜0.05)。另外,褐藻糖膠處理后,VEGF表達(dá)

6、也出現(xiàn)減少(P＜0.05)。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):結(jié)果顯示褐藻糖膠能抑制荷瘤小鼠移植瘤的增長(zhǎng);TUNEL染色顯示褐藻糖膠明顯促進(jìn)腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞凋亡;Westernblot結(jié)果顯示Bcl-2/Bax比值降低和Survivin的表達(dá)下降;免疫組化檢測(cè)到β-catinin、CyclinD1、CDK4和VEGF的表達(dá)減少,腫瘤組織微血管密度降低;癌灶在肺部的轉(zhuǎn)移率下降。
　　 結(jié)論:褐藻糖膠能明顯誘導(dǎo)4T1細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期G1期阻滯,抑制小鼠