miR-568抑制乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)外轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　乳腺癌的發(fā)生發(fā)展可分為多個(gè)層次多個(gè)步驟，轉(zhuǎn)移是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，常常導(dǎo)致病人的高死亡率。由于轉(zhuǎn)移過程比較復(fù)雜，我們需要從基礎(chǔ)和臨床兩方面入手，深入揭示乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，以利于獲取腫瘤發(fā)生的早期預(yù)警信號(hào)，及時(shí)的進(jìn)行診斷和干預(yù)，最終提高患者的治療效果和生活質(zhì)量，緩解、減輕社會(huì)和個(gè)人的負(fù)擔(dān)。腫瘤轉(zhuǎn)移過程非常復(fù)雜，通常涉及到許多轉(zhuǎn)移相關(guān)分子，而對(duì)單個(gè)分子的干預(yù)可能達(dá)不到所希望的成效。因?yàn)閙iRNA可以同時(shí)靶向多個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移

2、相關(guān)分子，使上述難題得以部分解決。近年來，miRNA與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究漸成為醫(yī)學(xué)熱點(diǎn)，其中關(guān)于miRNA與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究尤為火熱，但目前進(jìn)展還不盡如人意，許多問題尚待解決。除了已報(bào)道的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制miRNA，是否有新的miRNA參與其中呢？若存在，這些新的miRNA分子下調(diào)了何種轉(zhuǎn)移相關(guān)分子（靶分子）？靶分子（早已報(bào)道的或最近發(fā)現(xiàn)的）參與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制是什么？新miRNA分子逆轉(zhuǎn)腫瘤表型的能力是否可以在基礎(chǔ)與臨床研

3、究中得到一致性的證據(jù)呢？種種問題的提出和最終解決，必將為乳腺癌患者的治療帶來新的希望。
　　目的：
　　尋找并鑒定參與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的新miRNA分子，初步探討新miRNA分子以何種途徑來影響乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，這種作用結(jié)果是否可以在基礎(chǔ)功能研究和臨床觀察、檢測(cè)中獲得統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，最終為乳腺癌的早期預(yù)警、分子診斷和治療提供一定的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1．依據(jù)GEO profiles軟件查詢并分析NFAT5在乳腺

4、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的芯片數(shù)據(jù)中的表達(dá)情況。qRT-PCR和WB方法檢測(cè)NFAT5在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)，篩選得到高表達(dá)和低表達(dá) NFAT5的細(xì)胞系。siNFAT5 mimics轉(zhuǎn)染或者pLKO.1-GFP-shNFAT5穩(wěn)定感染MDA-MB-231細(xì)胞系后，劃痕實(shí)驗(yàn)、遷移侵襲實(shí)驗(yàn)、尾靜脈注射裸小鼠內(nèi)臟轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的遷移和侵襲能力。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)觀察乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)和增值狀況。
　　2．芯片結(jié)果結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)得知，NFAT5可

5、能受到miR-568的調(diào)控。利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果。qRT-PCR方法檢測(cè)miR-568在乳腺癌細(xì)胞系及臨床組織標(biāo)本中的表達(dá)。將miR-568 mimics、antagomiR-568 mimics分別轉(zhuǎn)染MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞后，檢測(cè)NFAT5的表達(dá)并且觀察目的細(xì)胞侵襲能力的變化。將穩(wěn)定感染pGCsil-miR-568的MDA-MB-231細(xì)胞接種于裸鼠右側(cè)后肢背部的皮下或尾靜脈注射裸小鼠，觀察其原位成瘤

6、及肺轉(zhuǎn)移情況。
　　3．qRT-PCR及WB方法檢測(cè)S100A4在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)，ChIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NFAT5與S100A4啟動(dòng)子的結(jié)合情況。將不同濃度的 siNFAT5 mimics轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，檢測(cè) S100A4 mRNA及其蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。在MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-568 mimics或antagomiR-568 mimics后，qRT-PCR檢測(cè)S100A4 mRNA的

7、表達(dá)變化。在MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siNFAT5或者siS100A4后，qRT-PCR、WB及間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EMT相關(guān)分子的表達(dá)（主要為E-cadherin和Vimentin）。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同級(jí)別乳腺癌組織中NFAT5、S100A4、E-cadherin及Vimentin的表達(dá)，并分析其相關(guān)性。siNFAT5、siS100A4或miR-568 mimics轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，qRT-PCR檢測(cè)CD44

8、、RhoA、MMP2和MMP9的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，WB檢測(cè)ERK、Akt及其磷酸化的表達(dá)水平。
　　4．qRT-PCR及ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞系及臨床送檢血液中VEGF-C的表達(dá)水平，分析其與乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。ChIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NFAT5與VEGF-C啟動(dòng)子的結(jié)合情況。將miR-568或siNFAT5 mimics轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，qRT-PCR及ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VEGF-C的表達(dá)
　　

9、5．qRT-PCR檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞系和乳腺癌患者組織中Hotair的表達(dá)。下調(diào)或過表達(dá)Hotair后，觀察乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的變化。單獨(dú)或聯(lián)合下調(diào)Hotair、SUZ12或者EZH2后，qRT-PCR檢測(cè)miR-568的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1．依據(jù)GEO profiles軟件查詢并分析已發(fā)表的乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的芯片數(shù)據(jù)可知，NFAT5在轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)的乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)較高。經(jīng)篩選得到了高表達(dá)和低表達(dá)NFAT5的乳腺癌

10、細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7。干涉NFAT5的表達(dá)后，MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力下降。NFAT5表達(dá)的下調(diào)抑制乳腺癌細(xì)胞的原位成瘤及肺臟轉(zhuǎn)移，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致表明，NFAT5能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
　　2．與芯片結(jié)果和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)相吻合，雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示miR-568可以靶向抑制NFAT5的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示在乳腺癌細(xì)胞系及臨床乳腺癌組織樣本中miR-568與NFAT5的表達(dá)呈負(fù)

11、相關(guān)。miR-568表達(dá)上調(diào)或下調(diào)試驗(yàn)結(jié)果表明，乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力隨之下降或上升，同時(shí)檢測(cè)NFAT5的表達(dá)變化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察到miR-568可以部分抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，但顯著降低其肺臟轉(zhuǎn)移能力。綜上所述，miR-568通過下調(diào)NFAT5的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
　　3．S100A4與NFAT5在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)趨勢(shì)基本相符。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NFAT5可以結(jié)合到S100A4的啟動(dòng)子區(qū)上，并正向調(diào)控其基因表達(dá)，

12、MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染siNFAT5或siS100A4后，qRT-PCR、WB及間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明，NFAT5通過上調(diào)S100A4來調(diào)控EMT相關(guān)分子E-cadherin，Vimentin等的表達(dá)。臨床乳腺癌組織標(biāo)本的免疫組化結(jié)果提示，NFAT5、S100A4的表達(dá)與E-cadherin呈負(fù)相關(guān)，與Vimentin呈正相關(guān)，并且其與臨床腫瘤TNM分級(jí)有良好的一致性。miR-568、siNFAT5或siS100A4轉(zhuǎn)染MDA-

13、MB-231細(xì)胞后，腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)分子CD44、RhoA、MMP2、MMP9等的表達(dá)均被下調(diào)，ERK及Akt的磷酸化程度降低，腫瘤細(xì)胞的抗脫落凋亡效應(yīng)下降。miR-568通過下調(diào)NFAT5間接抑制S100A4的表達(dá)，最終抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
　　4．qRT-PCR及ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明，在高侵襲力的乳腺癌細(xì)胞系中VEGF-C的表達(dá)相對(duì)較高。與技術(shù)縮胸或良性乳腺疾病患者相比，淋巴結(jié)或肺轉(zhuǎn)移乳腺癌患者的送檢血液樣本中VEGF-C的濃

14、度變化有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與S100A4的情形相同，VEGF-C受到NFAT5的正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控，qRT-PCR及 ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-568或siNFAT5 mimics后，VEGF-C的表達(dá)與分泌受到抑制。miR-568通過下調(diào)NFAT5間接抑制VEGF-C的表達(dá)，從而起到抑癌基因的作用。
　　5．qRT-PCR檢測(cè)Hotair在乳腺癌細(xì)胞系、乳腺癌及其匹配癌旁組織中的表達(dá)情況，Hotair的表達(dá)

15、與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)。以不同組合方式干涉Hotair、SUZ12或EZH2均可上調(diào)miR-568的表達(dá)，已知LincRNA Hotair可以表觀沉默基因的表達(dá)，據(jù)推測(cè)Hotair有可能通過表觀遺傳沉默的方式下調(diào)miR-568的表達(dá)來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論：
　　1.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了NFAT5可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，其可以作為一個(gè)潛在的有效的治療靶點(diǎn)。
　　2. miR-568在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)較低，

16、其可以通過下調(diào)NFAT5的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
　　3. NFAT5通過上調(diào)S100A4的表達(dá)來間接誘導(dǎo)EMT和促存活信號(hào)的發(fā)生，過表達(dá)miR-568或干涉掉NFAT5可逆轉(zhuǎn)上述表型。臨床樣本的免疫組化數(shù)據(jù)與上述基礎(chǔ)功能的研究結(jié)果體現(xiàn)出良好的一致性。miR-568通過下調(diào)NFAT5間接抑制S100A4的表達(dá)，最終表現(xiàn)為乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移抑制。
　　4. NFAT5通過誘導(dǎo)VEGF-C的表達(dá)與分泌進(jìn)而刺激淋巴管血管生成。過