乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNAs的研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重影響著全世界女性的身心健康。據(jù)統(tǒng)計：2010年美國新發(fā)惡性腫瘤中，乳腺癌病人占到26％；并且，乳腺癌在所有惡性腫瘤病人的死亡率中占據(jù)第三位。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因，但腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制目前尚不明了。迄今為止，文獻報道了大量乳腺癌發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的癌基因或抑癌基因，這些基因在乳腺癌進展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用。近來，微小RNA(microRNA，miRNA)由于其在調(diào)

2、控基因表達方面的重要作用，成為新的研究熱點。
　　 miRNAs一類長約18～22 nt的單鏈RNA，它不編碼任何蛋白質(zhì)，具有強大的調(diào)控基因表達作用。研究表明，miRNAs廣泛表達于各個物種和組織中，并在很多生理病理過程中，如細胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡和代謝以及腫瘤發(fā)生發(fā)展和腫瘤轉(zhuǎn)移中均扮演了重要角色。miRNAs通過與特定mRNA結(jié)合導(dǎo)致其降解或通過調(diào)節(jié)特定mRNA的蛋白質(zhì)翻譯過程來抑制其翻譯，從而負性調(diào)控靶基因表達。所以，在

3、腫瘤中miRNAs根據(jù)其靶基因的不同可以相應(yīng)發(fā)揮癌基因或者抑癌基因的角色。目前，在多種常見惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了異常的miRNAs表達，并且其表達與腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學特性相關(guān)。如：乳腺癌miR-335能夠抑制乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并且其表達量與患者無轉(zhuǎn)移生存期呈正相關(guān)，提示其可能扮演了抑癌基因的角色；而miR-10b在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞中高表達，并且具有促進乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的功能，提示其可能扮演了癌基因的角色。然而，miRN

4、As在乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的研究剛剛起步，其生物學作用和分子機制尚不明朗。
　　 在本研究中，我們將在不同侵襲特性的乳腺上皮細胞中篩選差異性表達的miRNAs，然后在體外研究中探索這些候選miRNA對乳腺癌細胞侵襲和遷移等生物學行為的影響及其分子機制，同時我們將在臨床乳腺樣本中檢測這些miRNAs的表達，分析其與乳腺癌患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，從而探索乳腺癌侵襲相關(guān)的miRNAs，為將來合理治療乳腺癌提供新的生物學靶點。<

5、br>　　 第一部分不同侵襲力乳腺上皮細胞差異性miRNA表達譜的研究
　　 目的：檢測不同侵襲力人乳腺上皮細胞株中miRNAs的表達譜，分析差異性表達的miRNAs，篩選出可能與乳腺癌細胞侵襲力相關(guān)的miRNAs。
　　 方法：應(yīng)用高通量miRNA芯片(miRBase數(shù)據(jù)庫11.0版)檢測人乳腺上皮細胞株HBL100、乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB-468和MDA-MB-231中miRNA的表達譜，通過圖像分析

6、和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法，篩選出差異性表達的miRNAs。使用實時熒光定量PCR(real-time PCR)方法驗證miRNA芯片結(jié)果，同時進一步在臨床人乳腺病變(良性病變和乳腺癌)組織中檢測miRNAs表達狀況。
　　 結(jié)果：將miRNA芯片分組為①低侵襲乳腺細胞組--HBL100和MCF-7，②高侵襲乳腺癌細胞組--MDA-MB-231和MDA-MB-468。對芯片數(shù)據(jù)進行SAM分析，根據(jù)兩組細胞miRNA相對表達量的差異和趨勢

7、，我們篩選出18個可能與乳腺癌細胞侵襲相關(guān)的miRNAs，其中7個miRNAs在高侵襲力乳腺癌細胞組顯著上調(diào)，11個miRNAs在高侵襲乳腺癌力細胞組顯著下調(diào)。我們選擇其中顯著下調(diào)的miR-339-5p和miR-340為進一步研究對象，real-time PCR檢測結(jié)果顯示它們在兩組乳腺細胞和新鮮乳腺組織中表達狀況與miRNA芯片一致。
　　 結(jié)論：侵襲力不同的乳腺上皮細胞miRNAs表達譜存在差異性表達，提示miRNAs可能參

8、與了乳腺癌侵襲行為的調(diào)控。
　　 第二部分 miR-339-5p和miR-340對乳腺癌細胞遷移和侵襲生物學行為作用的研究
　　 目的：檢測miR-339-5p和miR-340對人乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的生物學行為的作用。
　　 方法：以乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231為研究對象，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)分別將miR-339-5p和miR-340的抑制物(ASO)和模擬物(mimic)轉(zhuǎn)入細胞中，檢測乳腺

9、癌細胞增殖、遷移和侵襲行為的改變。使用原位分子雜交方法檢測臨床存檔石蠟包埋的乳腺癌和乳腺良性病變組織中miR-339-5p和miR-340表達，并且分析其與乳腺癌臨床病理特征和患者預(yù)后的關(guān)系。
　　 結(jié)果：過表達miR-339-5p和miR-340可以顯著抑制高侵襲乳腺癌細胞MDA-MB-231遷移和侵襲，下調(diào)內(nèi)源性miR-339-5p和miR-340表達可以顯著促進低侵襲乳腺癌細胞MCF-7的遷移和侵襲。上述兩種miRNA對乳

10、腺癌細胞增殖無顯著影響。臨床乳腺癌組織中miR-339-5p和miR-340表達較良性病變組織表達顯著下調(diào)，并且它們表達量與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期等呈顯著負相關(guān)，與患者預(yù)后生存期呈正相關(guān)。
　　 結(jié)論：miR-339-5p和miR-340在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展過程中可能發(fā)揮了重要作用，是乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的潛在生物學標志物。
　　 第三部分 miR-339-5p和miR-340抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲分子機制的研究

11、　　 目的：探索miR-339-5p和miR-340抑制人乳腺癌細胞遷移和侵襲生物學行為的分子機制。
　　 方法：利用生物信息學方法預(yù)測miR-339-5p和miR-340可能的靶基因，從中篩選可能參與調(diào)控乳腺癌細胞侵襲和遷移相關(guān)的潛在靶基因。通過體外實驗，轉(zhuǎn)染外源性miR-339-5p和miR-340 ASO或mimics后，通過real-timePCR及western-blot檢測轉(zhuǎn)染后潛在靶基因mRNA和蛋白表達?？寺∧?/p>

12、標基因3’UTR，將其與質(zhì)粒psiCHECK-2(含熒光素酶報告基因)連接后，與miR-339-5p和miR-340 mimics分別共轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞，進行熒光素酶報告實驗(Luciferase ReporterAssay)驗證它們的靶基因。
　　 結(jié)果：在miR-339-5p和miR-340眾多潛在靶基因中，分別選取BCL-6和c-Met為研究對象。轉(zhuǎn)染miR-339-5p和miR-340的ASO或mimics后，BCL-6和