乳腺癌肺轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的研究.pdf

1、第一部分乳腺癌不同轉(zhuǎn)移潛能細胞株表達差異蛋白的確定及其I臨床意義目的：復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科通過體內(nèi)連續(xù)篩選法建立了肺高轉(zhuǎn)移潛能的乳腺癌細胞MDA-MB-435HM。該細胞與其親代細胞MDA-MB-435有相同的遺傳背景但具有更高的肺轉(zhuǎn)移潛能。本研究試圖使用蛋白質(zhì)組學技術(shù)，比較兩者之間表達存在差異的蛋白，并探討其中3個蛋白在乳腺癌中的臨床意義。方法：聯(lián)合使用二維電泳(2-DE)和液相色譜．質(zhì)子阱．質(zhì)譜分析(LC-IT．MS)確定M

2、DA-MB-435HM細胞與其親代細胞MDA-MB-435之間表達差異的蛋白。使用實時定量RT-PCR(real-timequantitativeRT-PCR)和Western印跡的方法驗證其中3個蛋白在不同轉(zhuǎn)移潛能乳腺癌細胞株之間mRNA水平和蛋白水平的差異。使用免疫組化的方法檢測2003年1月～2004年1月，80例乳腺癌標本中3個蛋白的表達情況。 結(jié)果：共確定出11個在肺高轉(zhuǎn)移細胞MDA-MB-435HM與其親代細胞MDA

3、．MB-435之間表達存在差異的蛋白：peroxiredoxin6(PDX6)，cathepsinD前體，熱休克蛋白27(HSP27)，HSP60,原肌球蛋白l(TPMl)，TPM2，TPM3，TPM4，14-3-3proteinepsilon，腫瘤蛋白D54(tumorprotein，D54)和α結(jié)晶蛋白B鏈(AlphaB-crystallin，CRAB)。實時定量RT-PCR檢測顯示肺高轉(zhuǎn)移潛能細胞株中CRAB，HSP60和PDX6

4、的mRNA水平分別為其親代細胞的0．24倍、3．15倍和2．43倍。Western印跡分析表明CRAB的在MDA-MB-435HM中未見表達，但在MDA．MB-435細胞中表達；HSP60和PDX6蛋白在MDA-MB-435HM中上調(diào)。免疫組化染色顯示，CRAB的陽性率在淋巴結(jié)陰性乳腺癌患者中高于在淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者中(52．5％vs32．5％)，但差異無統(tǒng)計學意義(P=-0．113)；HSP60的陽性率在淋巴結(jié)陰性乳腺癌患者中低于在

5、淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者中(32．5％vs72．5％)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0．001)：PDX6的陽性率在淋巴結(jié)陰性乳腺癌患者中低于在淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者中(35．0％vs72．5％，P=0．002)。結(jié)論：HSP60與PDX6水平的升高可能與乳腺癌侵襲能力增加相關(guān)，具體機制尚待進一步研究。建立乳腺癌不同肺轉(zhuǎn)移潛能的乳腺癌細胞，結(jié)合應(yīng)用蛋白質(zhì)組學技術(shù)，可以為發(fā)現(xiàn)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移相關(guān)預后指標提供線索。 第二部分Trophini

6、n在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用 目的：探討trophinin在不同肺轉(zhuǎn)移潛能人乳腺癌細胞株的表達情況及該基因?qū)θ橄侔┘毎鸐DA-MB-435增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。 方法：使用免疫熒光的方法檢測trophinin在乳腺癌細胞株MDA-MB-435中的定位。通過RT-PCR的方法檢測雌激素對乳腺癌細胞株MCF7和MDA-MB-435的trophininmRNA水平的影響。實時定量RT-PCR檢測trophinin在肺高轉(zhuǎn)移潛

7、能乳腺癌細胞MDA-MB-435HM和其親代細胞MDA-MB-435中mRNA水平的差異?；趐cDNAI-trophinin載體構(gòu)建trophinin的表達載體pcDNA3．1(+)一trophinin。進一步通過基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)，上調(diào)MDA-MB-435細胞株的trophinin水平。觀察trophinin轉(zhuǎn)染后乳腺癌細胞株MDA-MB-435細胞增殖以及侵襲能力的改變，并運用RT-PCR和流式細胞等方法探討其可能的分子機制。進一步

8、建立相應(yīng)的人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型以驗i~trophinin在體內(nèi)乳腺癌移植瘤進展中的意義。 結(jié)果：Trophinin蛋白定位于細胞膜和細胞質(zhì)。雌二醇可以上調(diào)雌激素受體陽性的乳腺癌細胞株MCF7的trophillinmRNA水平，在20nM濃度時MCF7細胞株的trophininmRNA水平上調(diào)達到最高水平。但雌二醇對雌激素受體陰性的乳腺癌細胞株MDA-MB-435的trophininmRNA水平無明顯影響。實時定量RT-PC

9、R分析表明乳腺癌肺高轉(zhuǎn)移細胞MDA-MB-435HM的trophininmRNA水平是其親代細胞的3．6l倍。通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法獲得trophinin更高表達的MDA-MB-435人乳腺癌細胞。RT-PCR分析表明，2個轉(zhuǎn)染trophinin后的MDA-MB-435細胞克隆的trophininmRNA水平顯著上調(diào)。轉(zhuǎn)染后細胞增殖速度無明顯增加，流式細胞分析顯示未轉(zhuǎn)染MDA-MB-435細胞株、轉(zhuǎn)染pcDNA3．1(+)空質(zhì)粒的MDA-MB

10、-435細胞株以及轉(zhuǎn)染了pcDNA3．1(+)．trophinin的2個MDA-MB-435乳腺癌細胞克隆的S期比例無明顯差異，分別為44．2％，48．6％，59．2％和45．7％。RT-PCR分析表明與細胞增殖相關(guān)的cyclinA、cyclinDl和PCNA等基因的mRNA水平在轉(zhuǎn)染后無明顯變化。Transwell小室體外侵襲實驗顯示轉(zhuǎn)染組細胞有更強的侵襲能力，穿過matrigel膠的細胞數(shù)分別為平均每高倍視野(200×)81個細胞和

11、157個細胞。Trophinin轉(zhuǎn)染細胞移植瘤肺轉(zhuǎn)移灶顯著多于對照組。未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和2個轉(zhuǎn)染組的裸鼠平均肺表面轉(zhuǎn)移灶分別為26．3，24．5，53．8和54．4個。RT-PCR分析表明，轉(zhuǎn)染后與腫瘤血管生成相關(guān)的VEGF、bFGF以及與細胞侵襲能力相關(guān)的MMP2、MMP9等的mRNA水平未見明顯改變。但轉(zhuǎn)染trophinin后細胞的MMP7mRNA水平明顯增高。 結(jié)論：雌二醇可以調(diào)節(jié)雌激素受體陽性的人乳腺癌細胞株MCF