乳腺癌轉(zhuǎn)移相關基因和蛋白的篩選及信號轉(zhuǎn)導途徑的研究.pdf

1、摘要摘要乳腺癌是女性最普遍的惡性腫瘤，乳腺癌轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的主要原因，目前乳腺癌轉(zhuǎn)移的發(fā)病機理尚不十分清楚。本實驗室前期將人乳腺癌MCF一7細胞皮下接種SCID鼠，從轉(zhuǎn)移臟器中成功獲得了具有高轉(zhuǎn)移傾向的人乳腺癌LM一MCF一7細胞系(己獲得國家發(fā)明專利，ZL.031310264.5)。為進一步探討LM一MCF一7細胞高轉(zhuǎn)移的分子機制，闡明乳腺癌轉(zhuǎn)移機理，本研究應用具有不同轉(zhuǎn)移能力的MCF一7幾M一MCF一7細胞模型，篩選了乳腺癌轉(zhuǎn)移

2、相關的基因和蛋白，并對乳腺癌轉(zhuǎn)移相關的增殖和遷移的信號轉(zhuǎn)導途徑進行了深入研究，主要研究內(nèi)容如下:一、篩選乳腺癌轉(zhuǎn)移相關基因和蛋白應用基因芯片和蛋白質(zhì)組學技術(shù)比較了MCF一7和LM一MCF一7細胞中基因和蛋白表達譜的變化?；蛐酒埠Y選出差異表達基因121個，其中78個在LM.MCF一7細胞中表達上調(diào)，43個表達下調(diào)。應用實時定量又1飛PCR對其中7個基因進行了驗證，檢測結(jié)果與芯片一致蛋白質(zhì)組學檢測初步發(fā)現(xiàn)9個差異顯著的蛋白。應用認怡st

3、emblot檢測發(fā)現(xiàn)MLCK、Survivin和Bcl一2在LM一MCF一7細胞中高表達，而nm23和p27低表達。差異表達的基因和蛋白質(zhì)的功能廣泛涉及到細胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞茹附與轉(zhuǎn)移和代謝等多個方面。二、LM一MCF一7細胞高增殖和遷移能力及其信號轉(zhuǎn)導途徑的研究1.MCF一7和LM一MCF一7細胞增殖和遷移能力的比較流式細胞儀檢測結(jié)果顯示LM一MCF一7細胞的增殖指數(shù)為6076，高于MCF一7細胞的36月9，BrdU摻入實驗也得到

4、同樣結(jié)果軟瓊脂克隆形成實驗表明，LM一MCF一7細胞的惡性轉(zhuǎn)化能力高于MCF一7細胞瓊脂糖滴細胞遷移實驗、劃痕實驗和Boyden小室跨膜遷移等實驗顯示，LM一MCF一7細胞比MCF一7細胞具有更強的遷移能力。2.MAPK信號途徑與LM一McF一7細胞高增殖和遷移的關系我們從基因芯片檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，LNI一MCF一7細胞中MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑相關因子MAP7、FOS等基因高表達，提示MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑與乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關。因此，本研究應

5、用Westemblot檢測了MCF一7細胞和LM一MCF一7細摘要謝與LM一MCF一7細胞高增殖和遷移的關系。認怡Stemblot檢測發(fā)現(xiàn)，與AA釋放有關的cPLAZ抑制劑(AACOCF3)及AA代謝酶COX一2抑制劑(Indo)和LOX抑制劑(NDGA)可明顯下調(diào)LM一MCF一7細胞中p一EIUKI2的表達。BrdU摻入實驗和Boyden小室跨膜遷移實驗檢測發(fā)現(xiàn)，Ind。和NDGA可抑制LM一McF一7細胞的增殖和遷移。應用外源2印M

6、AA直接作用McF一7細胞，可明顯促進p一ERKI2的表達，并被Ind。、NDGA和PTX明顯抑制。以上結(jié)果表明，AA經(jīng)COX和LOX的代謝產(chǎn)物可能通過作用Gio蛋白激活下游相關信號途徑促進乳腺癌細胞的增殖和遷移。AA及其代謝產(chǎn)物均為脂類分子，可以分泌到細胞外。我們推測AA代謝產(chǎn)物除了可以促進LM一MCF一7細胞自身的增殖和遷移外，還可以對鄰近癌旁細胞發(fā)揮作用。于是我們用LM一MCF一7細胞的條件培養(yǎng)液作用MCF一7細胞，發(fā)現(xiàn)可濃度依賴

7、的促進MCF一7細胞中p一ERKI2的表達，并且可促進McF一7細胞的增殖能力，該作用也能被PTX抑制。上述結(jié)果證實了我們的假設。三、高轉(zhuǎn)移乳腺癌MDA一入IB一231細胞中細胞增殖和遷移相關信號途徑的研究為證實上述發(fā)現(xiàn)的乳腺癌細胞高增殖和遷移相關信號途徑的普遍性，我們應用了國內(nèi)外研究較多的高轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞系MDA一MB一231與MCF一7細胞進行比較，發(fā)現(xiàn)p一ERKI2、p一catenin、cyclinDI、survivin、cPLA

8、Z和cOX一2等在MDA一MB一231細胞中也高表達，并可被PD98059抑制，cPLAZ、COX、LOX和Gio蛋白的抑制劑均可下調(diào)p一ER長12的高表達。MDA一MB一23工細胞的條件培養(yǎng)液也可上調(diào)MCF一7細胞中p一ERKI2的表達，并受到p1X的抑制。上述結(jié)果提示MDA一MB一231細胞的增殖和遷移信號途徑與LM一MCF一7細胞相似。綜上所述，我們應用基因芯片和蛋白質(zhì)組學等方法，在具有高低不同轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細胞系中篩選出與乳腺

9、癌轉(zhuǎn)移密切相關基因和蛋白，為進一步研究高轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞系的增殖和遷移相關信號轉(zhuǎn)導途徑提供了信息和思路。本研究發(fā)現(xiàn)了高轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞系的高增殖和遷移的信號轉(zhuǎn)導途徑與壓oPLCPKCERKI2MLCK幣一MLC和ERKI2p一cateni可cyclinDI和Survivin等有關，人A的COX和LOX的代謝產(chǎn)物可激活該信號途徑。上述研究進一步闡明了孚L腺癌轉(zhuǎn)移的分子機制，為乳腺癌轉(zhuǎn)移的早期診斷、預防和治療奠定了理論基礎。關鍵詞:乳腺癌轉(zhuǎn)移E