蛻皮激素引發(fā)的鈣離子-鈣調蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ信號轉導途徑以及蛋白激酶A信號轉導途徑對基因組轉錄的調控.pdf

1、研究背景及存在的科學問題:
　　蛻皮激素(20-Hydroxyecdysone，20E)在昆蟲蛻皮和變態(tài)中起主導作用。過去認為20E直接進入細胞啟動基因轉錄，即基因組途徑。近年的研究中發(fā)現細胞膜上存在響應蛻皮激素的G蛋白偶聯(lián)受體(ErGPCRs)，它們能介導20E引發(fā)的細胞內Ca2+濃度的迅速升高，進而活化蛋白激酶C(PKC)信號轉導途徑，即非基因組途徑。胞內Ca2+濃度升高后需要與胞內多種鈣結合蛋白形成復合物來發(fā)揮作用，如鈣調蛋

2、白(calmodulin，CaM)。CaM可以結合4個Ca2+形成Ca2+/CaM活性復合物，進而結合鈣離子/鈣調蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)，使CaMKⅡ發(fā)生自磷酸修飾而活化?；罨蟮腃aMKⅡ在細胞核內可以磷酸化轉錄因子或其他蛋白，從而調節(jié)基因轉錄。但CaMKⅡ在20E調控的Ca2+信號途徑中的功能及作用機理尚不清楚。果蠅中的研究還發(fā)現細胞膜上的多巴胺/蛻皮激素受體(DmDopEcR)可以和20E結合并可以介導胞內cAMP濃度

3、升高;蛻皮激素在30 s內誘導家蠶前絲腺細胞內cAMP濃度升高，表明20E可能誘導cAMP介導的非基因組信號途徑。cAMP與依賴cAMP的蛋白激酶A(PKA)調節(jié)亞基(PKAR)結合，使其與催化亞基(PKAC)分離，進入細胞核，使環(huán)磷腺苷應答元件結合蛋白(CREB)磷酸化并結合到環(huán)磷腺苷應答元件(CRE)上，調控基因表達，即PKA信號轉導通路。然而20E激發(fā)的cAMP信號轉導途徑及其在調節(jié)昆蟲變態(tài)發(fā)育中的作用及機理并不清楚。
　　

4、方法：
　　本論文用鱗翅目昆蟲棉鈴蟲作為實驗材料，并利用棉鈴蟲表皮細胞系(HaEpi)平臺，研究了CaMKⅡ在20E調控的Ca2+信號途徑中的功能及作用機理、PKAC在20E調控的昆蟲變態(tài)發(fā)育中的作用及機理。
　　研究結果:
　　1.20E誘導CaMKⅡ磷酸化進而通過調節(jié)細胞核內EcRB1/USP1轉錄異源二聚體的形成來調控基因的啟動。
　　在棉鈴蟲蛻皮期和變態(tài)期CaMKⅡ表達量升高。在蟲體中通過RNA干擾技術(

5、RNAi)沉默CaMKⅡ導致20E誘導基因表達量下降，進而導致棉鈴蟲不能順利完成變態(tài)。在HaEpi細胞系中，20E快速誘導CaMKⅡ第290位蘇氨酸發(fā)生磷酸化，并使CaMKⅡ進入細胞核。GPCR抑制劑Suramin、磷脂酶C(PLC)抑制劑U73122以及1，4，5-三磷酸肌醇受體(IP3R)抑制劑光溜海綿素(Xestospongin C，XeC)對20E誘導的細胞內Ca2+濃度升高及CaMKⅡ磷酸化有顯著抑制作用。在細胞內沉默ErGP

6、CR1、ErGPCR2以及G蛋白alpha q（Gαq）也能抑制20E誘導的CaMKⅡ磷酸化。細胞核內的CaMKⅡ介導去乙?；?(HDAC3)的磷酸化并出核，維持轉錄因子USP1第303位賴氨酸乙?；?，使其與EcRB1形成轉錄異源二聚體，并與蛻皮激素響應元件(EcRE)結合。以上結果說明，20E通過ErGPCRs-、Gαq-、PLC-介導Ca2+信號轉導途徑調控CaMKⅡ磷酸化和核移位，進而調節(jié)USP1賴氨酸乙?；⑿纬蒃cRB1/U

7、SP1異源二聚體，最終調控基因組途徑的啟動。
　　2.20E引發(fā)細胞內PKA信號轉導途徑磷酸化CREB上調基因組轉錄途徑。
　　在棉鈴蟲幼蟲通過RNAi沉默PKA催化亞基1（PKAC1，導致幼蟲不能順利完成化蛹，并且20E誘導基因的表達量下降。GPCR抑制劑Suramin、cAMP生成抑制劑鹽酸布比卡因、以及沉默ErGPCR2都能抑制20E介導的PKAC1的磷酸化。PKAC1在細胞核內直接磷酸化CREB的第143位絲氨酸殘基

8、。20E可以誘導含有CRE及EcRE核心元件的pHR3-P-IE1-RFP-His質粒表達紅色熒光蛋白。GPCR抑制劑 Suramin、PKA抑制劑H89、以及沉默ErGPCR1和ErGPCR2都能抑制20E對該RFP的上調表達。缺失質粒中的CRE后，20E誘導RFP表達的能力下降。20E誘導CREB磷酸化并結合到CRE上，沉默PKAC1后CREB不能磷酸化因而不能結合到CRE上。這些結果說明，20E通過ErGPCR2介導PKAC1磷酸

9、化，進而使CREB發(fā)生磷酸化并結合到CRE元件上，增強20E誘導基因表達。
　　結論及意義:
　　20E調控CaMKⅡ氨基酸序列的第290位蘇氨酸磷酸化并入核，催化HDAC3磷酸化并出核，從而維持USP1在303位賴氨酸的乙?；揎?，與EcRB1結合形成EcRB1/USP1轉錄復合體并結合在EcRE上，啟動基因轉錄。20E通過ErGPCR2介導PKAC1磷酸化，PKAC1直接磷酸化CREB中的第143位絲氨酸殘基，使CREB