乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)基因的篩選及系統(tǒng)生物學(xué)分析.pdf

1、乳腺癌是全世界嚴(yán)重威脅女性健康的首位惡性腫瘤。在近十年里，不僅在發(fā)達(dá)國(guó)家里乳腺癌的發(fā)病率持續(xù)升高，發(fā)展中國(guó)家的乳腺癌患病率也已經(jīng)超過宮頸癌，成為了女性癌癥死亡的首位因素，且乳腺癌的發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。然而隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，乳腺癌的診治水平有了顯著的提高，使乳腺癌的死亡率明顯下降，并改善了患者的生活質(zhì)量。但是，乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然占有相當(dāng)大的比例，有文獻(xiàn)報(bào)道，乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)現(xiàn)象大約占乳腺癌患者中的10％~30%之多，且出現(xiàn)復(fù)發(fā)

2、的患者的治愈率也會(huì)明顯降低，嚴(yán)重影響患者的生存率。
　　系統(tǒng)生物學(xué)是一個(gè)以信息為基礎(chǔ)、以整合為靈魂、以干涉為鑰匙的對(duì)生物體系中所有組成包括基因、蛋白質(zhì)等的構(gòu)成進(jìn)行研究，并探尋其中相互關(guān)聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的新型生物學(xué)交叉學(xué)科。它的系統(tǒng)性及整體性研究就是該學(xué)科的特點(diǎn)。系統(tǒng)生物學(xué)方法的研究包含了多種學(xué)術(shù)理論的支持，其中包括生物信息學(xué)研究、計(jì)算信息學(xué)研究、基因組學(xué)研究等。生物信息學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)發(fā)展基礎(chǔ)的重要一部分，是一門以研究生物信息的采集、

3、儲(chǔ)存、處理、傳播為基礎(chǔ)的交叉學(xué)科。其總和了生命科學(xué)、信息學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)及計(jì)算機(jī)科學(xué)等多種技術(shù)手段，包含了海量的數(shù)據(jù)庫(kù)，還擁有多種在線分析軟件，收集并分析遺傳相關(guān)數(shù)據(jù)，探索生物學(xué)的奧秘。并對(duì)人類的基因及疾病發(fā)生相關(guān)的基因進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘、統(tǒng)計(jì)分析、功能注釋、通路分析及網(wǎng)絡(luò)可視化分析，從而對(duì)疾病尤其是惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有了更深一步的認(rèn)識(shí)。
　　本研究課題通過以Pubmed/Medline數(shù)據(jù)庫(kù)、Web of Science數(shù)據(jù)庫(kù)、CNKI（中

4、國(guó)知網(wǎng)）數(shù)據(jù)庫(kù)及萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的文獻(xiàn)挖掘?yàn)檠芯炕A(chǔ)，總結(jié)出與乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)的基因，通過文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)及系統(tǒng)生物學(xué)的方法對(duì)當(dāng)今研究現(xiàn)狀做出總結(jié)，并研究分析乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)基因及miRNA（microRNA，內(nèi)源性非編碼微小RNA）之間的相互作用關(guān)系，構(gòu)建ceRNAs（compting endogenous RNAs，競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源 RNAs）網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖，從而進(jìn)一步了解乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)基因的功能及作用通路，為探究乳腺癌復(fù)發(fā)的發(fā)生及發(fā)展的分子作用機(jī)

5、制提供更全面的信息和理論基礎(chǔ)，更為能夠進(jìn)一步預(yù)防和治療乳腺癌的復(fù)發(fā)提供新的研究方向。
　　第一部分：乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)基因的篩選及生物信息學(xué)分析
　　背景與目的：
　　乳腺癌是我國(guó)最常見的女性惡性腫瘤之一，其發(fā)病率仍以每年3%的趨勢(shì)上升，且發(fā)病越來越年輕化。乳腺癌不僅是一個(gè)激素依賴性惡性腫瘤，更是一個(gè)復(fù)雜的多基因性的全身性、終身性疾病，遺傳及環(huán)境等因素都參與了乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展，而乳腺癌的復(fù)發(fā)更讓我們認(rèn)識(shí)到這個(gè)疾病有著同其

6、他惡性腫瘤一樣的侵襲性和危險(xiǎn)性，它會(huì)大大降低乳腺癌患者的生存時(shí)間，嚴(yán)重威脅著廣大女性患者的生命?；蚪M學(xué)的發(fā)展讓我們?cè)絹碓蕉嗟牧私夂驼J(rèn)識(shí)腫瘤相關(guān)基因的功能及腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路的作用。
　　本研究的目的：通過對(duì)乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析，了解與乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)的基因的功能、信號(hào)通路及其表達(dá)蛋白質(zhì)之間的相互作用的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成，為探索乳腺癌復(fù)發(fā)的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　　檢索2001.01-2015.01期

7、間發(fā)表的所有關(guān)于乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)基因的中英文文章，通過納入以人類為限定物種且能夠提供乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)基因足夠信息的相關(guān)的研究文獻(xiàn)，排除綜述類及重復(fù)文獻(xiàn)等不相符文獻(xiàn)，篩選出有效文獻(xiàn)并提取所需要的數(shù)據(jù)，應(yīng)用NoteExpress文獻(xiàn)檢索與管理軟件及Excel2010軟件進(jìn)行納入文獻(xiàn)的管理及文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)分析，并匯總與乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)的基因。運(yùn)用基因注釋工具GATHER（Gene annotation tool to help explain rela

8、tionships）在線軟件（ http://gather.genome.duke.edu/）對(duì)乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)基因進(jìn)行GO（ Gene Ontology，基因本體）功能分析。應(yīng)用圖形化網(wǎng)絡(luò)顯示及分析編輯免費(fèi)開源軟件Cytoscape中的一個(gè)插件JEPETTO（Java Enrichment of Pathways Extended To Topology）(Version1.3.1)進(jìn)行 KEGG(Kyoto Encyclopedia

9、of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(kù))通路分析。采用STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins)在線軟件(http://string.embl.del/)繪制相關(guān)基因表達(dá)蛋白質(zhì)的互作網(wǎng)絡(luò)圖，并應(yīng)用Cytoscape軟件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)及各節(jié)點(diǎn)的拓?fù)涮匦院Y選出關(guān)鍵基因。
　　結(jié)果：
　　1．本研究共納入了196

10、篇中英文文獻(xiàn)，經(jīng)分析得出，在近14年里對(duì)于乳腺癌復(fù)發(fā)的相關(guān)基因的研究論文數(shù)量處于顯著上升的趨勢(shì)，并總結(jié)出59個(gè)相關(guān)基因。
　　2．GO分析發(fā)現(xiàn)乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)基因及其產(chǎn)物的功能主要集中在細(xì)胞周期的調(diào)控、膠原蛋白的分解代謝、細(xì)胞的增殖及細(xì)胞生理過程的負(fù)調(diào)控等。
　　3．KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)基因在信號(hào)通路中主要參與了腫瘤信號(hào)通路、P53信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路等。
　　4．經(jīng)STING軟件篩

11、選出59個(gè)相關(guān)基因中7個(gè)基因表達(dá)蛋白未參與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，52個(gè)相關(guān)基因表達(dá)蛋白存在相互作用，成功構(gòu)建了相關(guān)基因表達(dá)蛋白互作圖。
　　5．應(yīng)用Cytoscape軟件共篩選出7個(gè)關(guān)鍵基因，分別為，是TP53（腫瘤蛋白p53）、VEGFA（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A）、ESR1（雌激素受體1）、ERBB2（人表皮生長(zhǎng)因子受體2）、CDH1（上皮-鈣黏連蛋白）、PTEN（磷酸酶-張力蛋白抑癌基因）及MMP2（基質(zhì)金屬蛋白酶）。
　　結(jié)論：

12、>　　1．成功篩選出乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)的59個(gè)基因，并對(duì)其進(jìn)行GO功能注釋及KEGG通路分析，為乳腺癌復(fù)發(fā)的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)
　　2．成功構(gòu)建乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)基因的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖，并篩選出7個(gè)關(guān)鍵基因，提示TP53基因乳腺癌的復(fù)發(fā)過程密切相關(guān)，有利于研究相關(guān)基因的相互作用及密切關(guān)系，為乳腺癌復(fù)發(fā)的預(yù)防、診斷及治療提供了研究方向。
　　第二部分：乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)miRNA的篩選及ceRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
　　背景與目的：

13、　　非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA），是一類除mRNA、tRNA和rRNA以外的，不編碼蛋白質(zhì)卻發(fā)揮功能的RNA分子，它包含微小RNA（microRNA， miRNA）和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。microRNA是內(nèi)源性非編碼微小RNA的總稱，它可以通過與靶基因的結(jié)合從而引導(dǎo)沉默復(fù)合體降解mRNA或者阻礙其翻譯，抑制其轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)作用。ceRNA（comptin

14、g endogenous RNA，競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA）假說揭示了RNA之間相互作用的新機(jī)制。lncRNA是 ceRNA的其中一種，在細(xì)胞周期調(diào)控、分化調(diào)控、表觀遺傳學(xué)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。系統(tǒng)生物學(xué)作為一門信息科學(xué)，整合了基因組學(xué)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)等信息，系統(tǒng)分析其中的關(guān)聯(lián)性及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)造，構(gòu)建ceRNAs網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖，對(duì)于生命的整個(gè)過程如細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及凋亡等，以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，都起到了越來越重要的作用。
　　本研究目的：通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)

15、證的數(shù)據(jù)庫(kù)及靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)的miRNA-靶基因，miRNA-lncRNA匹配對(duì)數(shù)，運(yùn)用生物信息學(xué)分析，構(gòu)建相關(guān)ceRNAs網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖，了解其中的相互作用，篩選出與乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)的重要miRNA。
　　研究方法：
　　選用 POMA算法，利用3個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的數(shù)據(jù)庫(kù)： miRecords（http://mirecords.biolead.org/）、TarBase（http://diana.cslab.ec

16、e.ntua.gr/tarbase/）、miRTarBase（ http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/）及2個(gè)靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)：starBase（ http://www.targetscan.org/）和miRDB（http://www.microrna.org/microrna/home.do），采用Z=α/β公式（α代表僅受該miRNA調(diào)控的靶基因的個(gè)數(shù)。β代表受該 miRNA調(diào)控的所有靶基因的個(gè)數(shù)）。

17、以Z值＞0.1為閾值，共同篩選出Z值＞0.1的 miRNA定為有意義的乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)的miRNA，并找出miRNA-靶基因匹配對(duì)數(shù)。應(yīng)用starBase v2.0數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miRNA-lncRNA的相互關(guān)聯(lián)，找出相互作用的匹配對(duì)數(shù)。通過Cytoscape3.2.1軟件構(gòu)建乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖篩選相關(guān)重要miRNA。
　　結(jié)果：
　　1．本研究通過運(yùn)用POMA篩選預(yù)測(cè)模型，在3個(gè)提供實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的數(shù)據(jù)庫(kù)和2個(gè)靶基因預(yù)

18、測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上，篩選出乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)miRNA共104個(gè)。通過Z公式評(píng)分后，大于閾值的miRNA共12個(gè)，分別為：miR-204、miR-29c、miR-29b、miR-146a、miR-9、miR-491、miR-222、miR-27b、miR-324-5p、miR-124、miR-141及miR-122。并找出16對(duì)miRNA-靶基因?qū)?yīng)關(guān)系。
　　2．通過starBase數(shù)據(jù)庫(kù)中內(nèi)置的LncRNABase預(yù)測(cè)miRNA-l

19、ncRNA的相互關(guān)聯(lián)，檢索發(fā)現(xiàn)乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)的lncRNA共12個(gè)，分別為：NEAT1（核副斑點(diǎn)包裝轉(zhuǎn)錄本1）、MALAT1（肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1）、XIST（X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄本）、HCG18（人類主要組織相容性復(fù)合體組18）、KCNQ1OT1（KCNQ1相反鏈/反義轉(zhuǎn)錄物1）、SNHG7（小核仁RNA宿主基因7）、HOTAIR（HOX反轉(zhuǎn)錄 RNA）、TUG1（上調(diào)牛磺酸1）、GAS5（生長(zhǎng)阻滯特異轉(zhuǎn)錄本5）、HCP5（人類主要

20、組織相容性復(fù)合體p5）、H19（母系印跡表達(dá)轉(zhuǎn)錄本）、MIAT（心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本）。并得到40對(duì)miRNA-lncRNA對(duì)應(yīng)關(guān)系。
　　3．通過應(yīng)用Cytoscape軟件，成功將56對(duì)調(diào)控關(guān)系導(dǎo)入并構(gòu)建了ceRNAs網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖，篩選出4個(gè)與乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)重要 miRNA，分別為：miR-204、miR-29c、miR-29b及miR-146a。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建出了與乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)的ceRNAs網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖，并