新型融合蛋白PTD-GRB2-SH2和乳腺癌Ras信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)研究.pdf

1、生長因子受體連接蛋白2（Grb2）是由一個中央的SH2結(jié)構(gòu)域和兩個兩端的SH3結(jié)構(gòu)域組成，一端通過SH2結(jié)構(gòu)域激活受體酪氨酸激酶（RTK），另一端通過SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合鳥嘌呤核苷酸交換因子（SOS），進(jìn)一步激活下游通路信號分子，啟動MAPK級聯(lián)反應(yīng)，參與到腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中。
　　本實驗從Ras信號通路中的重要分子Grb2的SH2結(jié)構(gòu)域切入，以基因到蛋白水平兩種不同層次的干預(yù)方式為結(jié)合點，重點闡明Grb2-SH2結(jié)構(gòu)域在乳腺癌細(xì)胞中

2、的功能和地位，并采取基因重組的方法構(gòu)建含有Grb2－SH2結(jié)構(gòu)域和PTD結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，構(gòu)建好的融合蛋白通過PTD結(jié)構(gòu)域穿膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，根據(jù)SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合底物的活性競爭結(jié)合底物分子的機(jī)制影響乳腺癌的增殖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，從而達(dá)到干預(yù)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的目的。
　　實驗主要分為三部分：
　　1.構(gòu)建含有Grb2的SH2結(jié)構(gòu)域的原核融合蛋白載體pET-16b-PTD-Grb2–SH2及其突變體對照載體，通過酶切、DNA電泳及質(zhì)

3、粒測序鑒定分子量和序列均正確無誤后，用IPTG誘導(dǎo)原核蛋白表達(dá)，并經(jīng)過鎳柱純化獲取原核融合蛋白 pET-16b-PTD-GRB2-SH2，SDS-PAGE凝膠分析此純化蛋白確有表達(dá)并且分子量與預(yù)期一致。
　　2.將純化好的蛋白及其突變體對照蛋白加到培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，通過MTT實驗、Transwell腫瘤遷徙實驗、流式細(xì)胞凋亡檢測和EdU增殖實驗證明原核融合蛋白PTD-GRB2-SH2對乳腺癌

4、細(xì)胞系MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖以及遷移能力都有一定的抑制作用，但對凋亡有促進(jìn)作用。
　　3.應(yīng)用Gateway系統(tǒng)構(gòu)建含有Grb2的SH2結(jié)構(gòu)域的真核融合蛋白載體plenti-PTD-Grb2–SH2及其突變體對照載體，通過酶切、DNA電泳及質(zhì)粒測序鑒定分子量與序列正確無誤后，利用三種慢病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后收取含病毒顆粒的上清，感染T淋巴瘤細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞，用藥物Blasticidin篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，Wes