培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸對三陰性乳腺癌體內(nèi)外抗腫瘤作用及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、研究目的:研究培美曲塞、唑來膦酸及二者聯(lián)合應(yīng)用對三陰性乳腺癌的體內(nèi)外抗腫瘤作用效果及用藥安全性;明確Mina53基因在三陰性乳腺癌中的表達(dá)情況及對其三陰性乳腺癌生物學(xué)行為的影響;探討培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸對三陰性乳腺癌的協(xié)同抗腫瘤作用機(jī)制。
　　研究方法:1）CellTiter96(@)AQueous One Solution Cell Proliferation Assay法檢測培美曲塞、唑來膦酸對三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-2

2、31-fLuc-GFP的生長抑制作用及篩選實(shí)驗(yàn)最適濃度，驗(yàn)證培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸對三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231-fLuc-GFP的生長是否有協(xié)同抑制作用;流式細(xì)胞儀碘化丙啶(PI)染色法及AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測培美曲塞、唑來膦酸及二者聯(lián)合應(yīng)用對三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231-fLue-GFP的細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響;Realtime-PCR方法檢測培美曲塞、唑來膦酸及二者聯(lián)合應(yīng)用對三陰性乳腺癌細(xì)胞MD

3、A-MB-231-fLuc-GFP中CyclinD1、MMP2、VEGF、Bax、Bcl-2基因的mRNA表達(dá)的影響。2）在裸鼠皮下建立三陰性乳腺癌異種移植瘤動物模型;通過用游標(biāo)卡尺測量計算腫瘤體積的變化趨勢，用小動物活體成像儀采集腫瘤自發(fā)熒光信號變化趨勢來比較培美曲塞、唑來膦酸及二者聯(lián)合應(yīng)用對三陰性乳腺癌的體內(nèi)抗腫瘤作用效果;通過觀察裸鼠的行為、活動及體重的變化來評估用藥的安全性;用免疫組化檢測法觀察培美曲塞、唑來膦酸及二者聯(lián)合應(yīng)用對

4、腫瘤組織中CD31、CD11b的蛋白表達(dá)的影響。3）Real time-PCR方法檢測三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231-fLuc-GFP、Luminal型乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、HER-2過表達(dá)型乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3及人類正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A中Mina53基因的mRNA表達(dá)情況;Western bolt方法檢測MDA-MB-231-fLuc-GFP、MCF-7、SK-BR-3及MCF-10A細(xì)胞系中Mina53蛋

5、白表達(dá)情況;利用RNA干擾技術(shù)siRNA-Mina53轉(zhuǎn)染MDA-MB-231-fLuc-GFP細(xì)胞，抑制其中Mina53基因的表達(dá);用Real time-PCR方法檢測siRNA-Mina53的轉(zhuǎn)染效率同時篩選siRNA-Mina53對三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231-fLuc-GFP中Mina53基因表達(dá)的抑制的最佳轉(zhuǎn)染濃度;Western bolt方法檢測siRNA-Mina53的轉(zhuǎn)染效率同時篩選siRNA-Mina53對三陰

6、性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231-fLuc-GFP中Mina53蛋白表達(dá)抑制的最佳轉(zhuǎn)染濃度;CellTiter96(@)AQueous One Solution Cell Proliferation Assay法檢測Mina53基因表達(dá)沉默對三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231-fLuc-GFP增殖的影響;流式細(xì)胞儀碘化丙啶(PI)染色及AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測Mina53基因表達(dá)沉默對三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-2

7、31-fLuc-GFP細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響;Transwell實(shí)驗(yàn)檢測Mina53基因表達(dá)沉默對三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231-fLuc-GFP細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響;細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測Mina53基因表達(dá)沉默對三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231-fLuc-GFP細(xì)胞粘附能力的影響;Real time-PCR方法檢測Mina53基因表達(dá)沉默對三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231-fLuc-GFP中CyclinD1、MMP2、

8、VEGF、Bax、Bcl-2基因mRNA表達(dá)量的影響。4) Real time-PCR方法檢測培美曲塞、唑來膦酸及二者聯(lián)合應(yīng)用對三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231-fLuc-GFP中Mina53基因mRNA表達(dá)量的影響;Western bolt方法檢測培美曲塞、唑來膦酸及二者聯(lián)合應(yīng)用對三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231-fLuc-GFP中Mina53蛋白表達(dá)量的影響;免疫組化法檢測培美曲塞、唑來膦酸及二者應(yīng)用對三陰性乳腺癌組織中Mi

9、na53的蛋白表達(dá)的影響。
　　研究結(jié)果:1）培美曲塞與唑來膦酸對三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231-fLuc-GFP的生長均有抑制作用，而且抑制作用具有濃度依賴性，隨著藥物濃度的升高而增強(qiáng);體外實(shí)驗(yàn)中培美曲塞對MDA-MB-231-fLuc-GFP細(xì)胞的最造抑制濃度為10μmol/L，唑來膦酸對MDA-MB-231-fLuc-GFP細(xì)胞的最適抑制濃度為100μmol/L，培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸組細(xì)胞活度較單獨(dú)用藥組明顯降低(P＜

10、0.05)，且二者聯(lián)合用藥指數(shù)CI=0.325＜1，說明培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸對三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231-fLuc-GFP的增殖具有協(xié)同抑制作用;與對照組相比，培美曲塞、唑來膦酸、培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸均可使處于細(xì)胞周期亞G0/G1期與G0/G1期的MDA-MB-231-fLuc-GFP細(xì)胞比例增加，但培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸應(yīng)用使阻滯于G1期之前的細(xì)胞所占比例顯著高于單獨(dú)用藥所占的比例(P＜0.001)，同時聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖指數(shù)

11、PI=0.51889，明顯低于對照組及單獨(dú)用藥組;與對照組相比，培美曲塞組、培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸組細(xì)胞總凋亡率均顯著增高(P＜0.01，P＜0.001)，而唑來膦酸組細(xì)胞總凋亡率無明顯增高(P＞0.05),但培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸組的總凋亡率高于培美曲塞組(P＜0.05);培美曲塞、唑來膦酸、培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸均可使三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231-fLuc-GFP中CyclinD1、MMP2及VEGF基因的mRNA表達(dá)量降低，且聯(lián)

12、合用藥組的表達(dá)量低于單獨(dú)用藥組CyclinD1(P＜0.05)、MMP2(P＜0.01)及VEGF(P＜0.05)。與對照組相比，培美曲塞組(P＜0.05)、培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸組(P＜0.001)可以顯著提高Bax/Bcl-2比值，且培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸組的升高水平顯著高于培美曲塞組(P＜0.001),但唑來膦酸組Bax/Bcl-2比值升高不明顯(P＞0.05)。2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，至觀察終點(diǎn)，與對照組相比，無論是培美曲塞、唑來膦酸單獨(dú)

13、用藥還是二者聯(lián)合用藥均未對荷瘤裸鼠的行為、活動及體重產(chǎn)生明顯影響;培美曲塞、唑來膦酸及二者聯(lián)合用藥均可對三陰性乳腺癌腫瘤生長起到抑制作用，培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸組對腫瘤體積的抑制率最高達(dá)到了86.942±3.695％，明顯高于培美曲塞組的53.238±5.513％和唑來膦酸組的31.506±6.359％，兩者之間比較差別均有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001，P＜0.001)，而且培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸組的腫瘤體積抑制率高于相同劑量的培美曲塞

14、與唑來膦酸分別給藥組的腫瘤體積抑制率之和;至觀察終點(diǎn)時，培美曲塞組、唑來膦酸組及培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸組的腫瘤自發(fā)熒光信號強(qiáng)度均低于對照組(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01)，且培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸組的腫瘤自發(fā)熒光信號強(qiáng)度也低于單獨(dú)用藥組(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)中各組腫瘤組織免疫組化結(jié)果顯示:培美曲塞、唑來膦酸均可抑制腫瘤組織中CD31蛋白的表達(dá)，二者聯(lián)合用藥后抑制作用更明顯;唑來膦酸對腫瘤組織中CD11b蛋白表達(dá)有明顯的抑制作用，

15、培美曲塞對其抑制作用不明顯，二者聯(lián)合用藥后抑制作用未見明顯增強(qiáng)。3）與正常乳腺上皮細(xì)胞相比，Mina53在乳腺癌各亞型細(xì)胞系中的表達(dá)量均顯著增高(P＜0.001)，且三陰性乳腺癌亞型細(xì)胞系MDA-MB-231-fLuc-GFP中Mina53的表達(dá)量均顯著高于其它亞型乳腺癌細(xì)胞系(P＜0.001);siRNA-Mina53可有效轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231-fLuc-GFP細(xì)胞，抑制細(xì)胞中Mina53的表達(dá)，且空白對照組（正常 MDA-MB

16、-231-fLuc-GFP細(xì)胞）與陰性對照組（siRNA-control-MDA-MB-231-fLuc-GFP細(xì)胞）細(xì)胞中Mina53的mRNA及蛋白的表達(dá)量均無明顯差別(P＞0.05)，經(jīng)過驗(yàn)證，脂質(zhì)體:siRNA-Mina53=1∶2比例配合的濃度為最適轉(zhuǎn)染濃度，對細(xì)胞中Mina53表達(dá)的抑制效率最高;與對照組相比，siRNA-Mina53轉(zhuǎn)染MDA-MB-231-fLuc-GFP細(xì)胞靶向沉默Mina53基因表達(dá)后細(xì)胞增殖率自第4

17、8h開始顯著降低(P＜0.001)，被阻滯在亞G0/G1期與G0/G1期的細(xì)胞所占比例顯著增高(P＜0.001)，細(xì)胞總凋亡率顯著增高(P＜0.001)，同時，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的遷移、侵襲及粘附能力均顯著降低(P＜0.001);與對照組相比，siRNA-Mina53轉(zhuǎn)染MDA-MB-231-fLuc-GFP細(xì)胞靶向沉默Mina53基因表達(dá)后的細(xì)胞中CyclinD1、MMP2及VEGF基因的mRNA表達(dá)量均顯著降低，(P＜0.0001)，但凋亡

18、相關(guān)基因Bax、Bcl-2的mRNA表達(dá)量的比值(Bax/Bcl-2反應(yīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平)顯著增高(P＜0.001)。4)培美曲塞組、培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸組處理的MDA-MB-231-fLuc-GFP細(xì)胞中Mina53基因的mRNA表達(dá)量均顯著低于對照組(P＜0.001，P＜0.001)，但在唑來膦酸組中降低不明顯(P＞0.05),而且培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸組中Mina53基因mRNA表達(dá)量顯著低于培美曲塞組(P＜0.001)，

19、在后續(xù)的不同藥物處理組細(xì)胞及腫瘤組織中Mina53蛋白表達(dá)水平的檢測中也得出了類似的結(jié)果。
　　研究結(jié)論:
　　1.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí):培美曲塞與唑來膦酸聯(lián)合應(yīng)用對三陰性乳腺癌具有協(xié)同抗腫瘤作用。且在一定的濃度范圍內(nèi)培美曲塞與唑來膦酸聯(lián)合用藥是安全的，荷瘤裸鼠對培美曲塞與唑來膦酸聯(lián)合用藥的耐受性良好，無嚴(yán)重的副作用發(fā)生。
　　2.與正常乳腺上皮細(xì)胞相比，乳腺癌細(xì)胞中Mina53是高表達(dá)的。且Mina53在三陰性乳腺癌

20、細(xì)胞中的表達(dá)水平高于其他亞型的乳腺癌細(xì)胞。靶向沉默Mina53基因能顯著降低三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231-fLuc-GFP的增殖、遷移、侵襲及粘附能力，并對細(xì)胞中CyclinD1、MMP2、VEGF、Bax/Bcl-2的表達(dá)產(chǎn)生影響，提示Mina53有望成為作為三陰性乳腺癌的基因治療靶點(diǎn)。
　　3.培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸對三陰性乳腺癌的協(xié)同抗腫瘤機(jī)制可能為:培美曲塞可以抑制三陰性乳腺癌中Mina53的表達(dá)，而Min53表達(dá)水

21、平的降低會引起三陰性乳腺癌中CyclinD1、MMP2、VEGF等表達(dá)水平的下調(diào)及凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2的mRNA表達(dá)量的比值(Bax/Bcl-2反應(yīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平)升高，從而降低三陰性乳腺癌中腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及粘附能力，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用;而唑來膦酸則是通過降低三陰性乳腺癌腫瘤細(xì)胞微環(huán)境中的CD11b陽性表達(dá)的M2型巨噬細(xì)胞的浸潤，進(jìn)而降低由其分泌和釋放的MMP2和VEGF等因子的表達(dá)水