非諾貝特在三陰性乳腺癌中的抗腫瘤作用及其機制的研究.pdf

1、目的:研究非諾貝特體內(nèi)、外抑制三陰性乳腺癌生長的作用及其機制。
　　方法:采用細胞計數(shù)試劑盒-8法（Cell count kit-8，CCK-8）檢測細胞生長能力，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，流式細胞儀檢測凋亡細胞比例和細胞周期分布比例，免疫印跡法檢測相關(guān)通路蛋白水平，全基因表達譜芯片技術(shù)檢測差異表達的特征基因功能類和通路變化。MDA-MB-231移植瘤小鼠模型驗證體內(nèi)抑制移植瘤生長能力，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端

2、標記法(Terminal deox-ytransferase-catalyzed DNA nick-end labeling，TUNEL)檢測瘤體組織切片中細胞凋亡的情況，裸鼠眼球采血，檢測血常規(guī)及肝腎功能指標。
　　結(jié)果:1.非諾貝特能夠抑制乳腺癌細胞株的生長能力，其中對非諾貝特最為敏感的前五個細胞株均為三陰性乳腺癌(Triple-negative breast cancer，TNBC)細胞株:MDA-MB-231、MDA-MB

3、-453、BT549、MDA-MB-436和MDA-MB-231-LU(指具有肺轉(zhuǎn)移潛力的細胞亞系)，它們的半數(shù)抑制濃度(50％ inhibitory concentration，IC50)分別為(16.07±4.44)μM、(26.72±10.04)μM、(34.47±13.88)μM、(74.46±17.75)μM和(82.09±21.21)μM，并呈現(xiàn)劑量依賴性，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231經(jīng)非諾貝特處理24小時后細胞

4、形態(tài)明顯改變，活細胞數(shù)明顯減少。
　　2.非諾貝特能夠誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞凋亡，呈時間劑量依賴性。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，MDA-MB-231細胞經(jīng)非諾貝特處理24小時后，PE AnnexinⅤ和7-AAD雙陽性的細胞比例0μM劑量組對100μM劑量組為4.8％對26.0％，上升了21.2％;非諾貝特處理48小時后，PE AnnexinⅤ和7-AAD雙陽性的細胞比例0μM劑量組對100μM劑量組為5.8％對48.0％，上升

5、了42.2％;不同時間點相比，48小時100μM劑量組的凋亡細胞比例對24小時100μM劑量組為48％對26％，增高了22％，其他劑量點也有不同比例的上升，并伴有Bad蛋白上調(diào)，Bcl-xl、Survivin下調(diào)，激活caspase-3。
　　3.非諾貝特能夠誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞系出現(xiàn)G1期細胞周期阻滯。MDA-MB-231細胞經(jīng)非諾貝特處理24小時后，0μM和50μM劑量組的G1期細胞所占比例分別為49.2％對61.3％

6、;非諾貝特處理36小時后，0μM和50μM劑量組的分別為47.9％對61.5％，呈現(xiàn)劑量依賴性，并伴隨Cyclin D1、Cdk4蛋白水平的下調(diào)，p21、p27/Kip1蛋白水平的上調(diào)。
　　4.過氧化物酶增殖物激活受體-α(Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha，PPAR-α)特異性抑制劑GW6471并不能逆轉(zhuǎn)非諾貝特抑制MDA-MB-231細胞生長和誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。

7、在MDA-MB-231細胞生長方面，非諾貝特各濃度組(0、12.5、25、50和100μM)的72小時生存率對非諾貝特各濃度組(0、12.5、25、50和100μM)聯(lián)合5μMGW6471的72小時生存率分別為(100±9.14)％對(99.90±9.23)％、(55.74±5.43)％對(58.60±4.10)％、(48.76±5.16)％對(41.43±3.66)％、(34.97±2.82)％對(28.92±2.94)％、(31.6

8、9±3.43)％對(25.71±2.84)％，各組p值均大于0.05，無統(tǒng)計學(xué)差異;在MDA-MB-231細胞凋亡方面，單用50μM非諾貝特處理24小時和50μM非諾貝特聯(lián)合5μ GW6471處理24小時的凋亡細胞比例分別為(21.55±2.47)％和(20.15±1.34)％，p＞0.05，兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　5.非諾貝特的抗腫瘤作用可能主要與NF-κB信號通路激活相關(guān)，另外，Akt1和Erk1/2信號通路的抑制也參與其抗

9、腫瘤作用。免疫印跡結(jié)果顯示，MDA-MNB-231細胞經(jīng)非諾貝特處理48小時后，NF-κB信號通路被激活，利用NF-κB通路的特異性抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸(Pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)能夠逆轉(zhuǎn)非諾貝特誘導(dǎo)細胞凋亡的作用，單用50μM非諾貝特處理24小時后凋亡細胞比例達到(20.45±0.92)％，而50μM非諾貝特聯(lián)合10nM PDTC處理24小時后凋亡細胞比例降至（6.5±0.85）％，p＜0

10、.004，兩組間有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　6.全基因表達譜芯片結(jié)果顯示，在基因本體(Gene ontology，GO)的生物過程變化最顯著的十個分類中，七個分類與細胞死亡相關(guān)，四個分類與細胞凋亡相關(guān)，下調(diào)最明顯的十條通路中，與細胞周期相關(guān)的通路排名第一，與腫瘤相關(guān)的通路排名第四。
　　7.非諾貝特能夠抑制MDA-MB-231移植瘤小鼠模型中的移植瘤生長，誘導(dǎo)移植瘤細胞凋亡。連續(xù)灌胃給藥32天后，非諾貝特治療組瘤體大小對對照組為（1

11、786.76±384.39）mm3對（2788.35±759.88）mm3，p＜0.001，具有統(tǒng)計學(xué)差異，抑制率達35.92％; TUNEL法檢測結(jié)果顯示，非諾貝特治療組的凋亡細胞比例對對照組的凋亡細胞比例為（36.22±0.94）％對(17.84±6.60)％，p＜0.0001，具有統(tǒng)計學(xué)差異;在安全性評價方面，對照組和非諾貝特治療組在白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷