HLA-B-2704-2705永生化細(xì)胞株的建立、重鏈cDNA的可溶性表達(dá)及其拮抗肽的篩選鑒定.pdf

1、強(qiáng)直性脊柱炎(Ankylosing spotldylitis，AS)是嚴(yán)重危害人類健康的常見病和多發(fā)病，在我國人群中患病率為0.2％～6％。脊柱炎癥病變從骶髂關(guān)節(jié)逐漸蔓延至頸椎，晚期常致關(guān)節(jié)嚴(yán)重變形，致使患者喪失勞動能力，導(dǎo)致生活質(zhì)量明顯下降。有關(guān)AS治療策略的探索始終是國內(nèi)外尤為關(guān)注的焦點(diǎn)、熱點(diǎn)和難點(diǎn)。然而，時(shí)至今日由于對AS的病因認(rèn)識不清，對其病機(jī)了解不透，目前尚無任何特異性根治療法。所使用的藥物與方案必然也就是非特異性緩解對癥療法

2、，雖具有一定的對癥緩解之效，但都是非靶向性的、對癥不對因，也就必然會產(chǎn)生多種多樣的嚴(yán)重毒副作用。因此，深入探索能有效防治AS的特異性新療法或新藥物是當(dāng)今風(fēng)濕病學(xué)、免疫學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域亟待解決的重大問題。 上世紀(jì)七十年代初，美國科學(xué)家Brewerton和Schlosstein首先發(fā)現(xiàn)HLA-B27與AS之間存在著非常強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，隨后的大量研究結(jié)果都支持HLA-B27與AS之間在遺傳學(xué)上密切關(guān)聯(lián)的學(xué)說。近些年的實(shí)驗(yàn)研究業(yè)已表明，減少或阻

3、斷B27重鏈分子可以明顯減輕癥狀和降低疾病的發(fā)生，其治療機(jī)制可能是通過封閉B27分子的肽結(jié)合位點(diǎn)來阻斷其呈遞自身分子的功能，或干擾淋巴細(xì)胞對B27重鏈自身的識別來特異性阻斷B27重鏈引起的病理性免疫反應(yīng)。為此，本研究采用噬菌體展示技術(shù)擬篩選出HLA—B27重鏈相應(yīng)的特異性結(jié)合肽，通過其與B27分子高度特異性結(jié)合，從而達(dá)到有效阻斷自身免疫、預(yù)防和緩解AS的目的?；诮Y(jié)合肽的這一功能我們稱之為HLA-B27分子拮抗肽(antagorlist

4、ic peptide)。從理論上講，與目前的全身性免疫抑制療法和抗炎對癥治療等非特異性治療相比， HLA-B27分子拮抗肽治療將會有更好的療效和更輕的全身毒副作用。 HLA-B27分子是一種表達(dá)于所有有核細(xì)胞表面的人類主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類分子，由6號染色體MHC區(qū)編碼的α重鏈及非MHC區(qū)編碼的β2微球蛋白輕鏈組成，其亞型為HLA-B*2701～HLA

5、-B*2725。在中國漢族人群中，B*2704和B*2705亞型構(gòu)成了B27的優(yōu)勢型別，分別占50.85和40.68％。對中國漢族B27陽性AS患者的亞型分析亦顯示B*2704頻率最高，占54.8％，其次是B*2705，占41.1％，所以HLA-B*2704及B*2705基本涵蓋了中國AS人群，因此我們選擇這兩個(gè)亞型作為本課題的研究靶標(biāo)。 本研究第一部分是建立HLA-B*2704/B*2705永生化細(xì)胞株及克隆并鑒定其重鏈cDN

6、A。首先從HLA-B*2704/B*2705陽性個(gè)體外周血中分離獲得B淋巴細(xì)胞，然后建立EBV轉(zhuǎn)化的HLA-B*2704/B*2705永生化細(xì)胞株，并對建立的細(xì)胞株進(jìn)行了相關(guān)生物學(xué)特性的檢測。檢測結(jié)果提示轉(zhuǎn)化后的HLA-B*2704/B*2705淋巴細(xì)胞具有永生性，且沒有惡性轉(zhuǎn)化的特征，核型分析無異常，裸鼠接種無致瘤性，基本保持了原代B淋巴細(xì)胞的生物學(xué)特征，屬一般轉(zhuǎn)化的細(xì)胞株。由此表明我們成功地建立了HLA-B*2704/B*2705陽

7、性永生化細(xì)胞株，這為后續(xù)實(shí)驗(yàn)和國際間的交流提供了穩(wěn)定的標(biāo)本來源。隨后，分別從建立的永生化細(xì)胞株及HLA-B*2704/B*2705陽性個(gè)體的外周血單個(gè)核細(xì)胞中提取總RNA，RT-PCR擴(kuò)增得到B*2704/B*2705重鏈的全長cDNA片段，將其連接測序載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，酶切鑒定后測序表明，結(jié)果與Geribank中的已知序列數(shù)據(jù)完全一致，這為進(jìn)一步進(jìn)行HLA-B*2704/B*2705重鏈在原核系統(tǒng)中的可溶性蛋白表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

8、 本研究第二部分是將編碼HLA-B*2704和HLA-B*2705分子的重鏈胞外區(qū)cDNA在E．coli中進(jìn)行可溶性表達(dá)。以HLA-B*2704/B*2705重鏈全長cDNA為模板，設(shè)計(jì)重鏈胞外區(qū)引物，PCR擴(kuò)增HLA-B*2704/B*2705的重鏈胞外區(qū)編碼序列，并插入到pEF32a-c(+)融合表達(dá)載體中，熱休克轉(zhuǎn)化Origami宿主菌，陽性菌落活化后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得了重組融合蛋白的高效表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白的>50％。

9、進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，可溶性表達(dá)與包涵體之間的比例與誘導(dǎo)溫度密切相關(guān)，30℃誘導(dǎo)主要以可溶性形式存在，而37℃誘導(dǎo)主要以包涵體的形式存在，在不同誘導(dǎo)溫度條件下，可溶性蛋白所占的比例依次為30℃>25℃>37℃，這可能與不同溫度環(huán)境下菌體內(nèi)微環(huán)境的不同而造成的蛋白溶解度的改變有關(guān)，而IPTG濃度對產(chǎn)量無顯著影響。由此表明本研究實(shí)現(xiàn)了B*2704/B*2705重鏈胞外區(qū)蛋白的高效可溶性表達(dá)，并獲得較純的目的蛋白，純度≥80％；阻斷試驗(yàn)表明，pE

10、T32a-c(+)-B*2704或B*2705表達(dá)上清可阻斷抗HLA-B27抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴性淋巴細(xì)胞毒反應(yīng)，說明本研究獲得了具有生物活性的HLA-B*2704或B*2705重鏈胞外區(qū)，為進(jìn)行噬菌體隨機(jī)肽庫的篩選及其他相關(guān)工作創(chuàng)造了條件。 本研究第三部分則是進(jìn)行HLA-B*2704及B*2705拮抗肽的篩選和初步鑒定。將可表達(dá)獲得的重組蛋白用酶聯(lián)板法來篩選噬菌體隨機(jī)12肽庫，經(jīng)過3輪生物淘洗(biopanning)后，噬菌體克

11、隆得到了有效富集。隨機(jī)挑取20～40個(gè)噬菌體克隆(其中從B*2704挑選12個(gè)克隆，B*2705挑選10個(gè)克隆)進(jìn)行ELISA檢測分析和單鏈DNA(single strand DNA，ssDNA)序列測定表明。獲得的HLA-B*2704拮抗肽共有5種序列，分別為：1、HTSFCSTHLCLI(×4)，2、QHCSLTLCQIHR(×5)，3、ARCTTTLCYLSN(×1)，4、YGLCTDWYCHIT(×1)，5、YPLCDAILCR

12、LP(×1)；10個(gè)B*2705拮抗肽共有4種序列，分別為：1、SHCSPHWCALPF(×6)，2、HLCSNSLCLLPW(×2)，3、EPMCSWFWCTLP(×1)，4、WTCSPLLCTWGA(×1)。比對分析表明，B*2704與B*2705拮抗肽的序列是基本一致的，均含有CS(T)TXXl(W)CXL表位，說明此表位可能是拮抗肽與B*2704/B*2705分子重鏈的主要拮抗表位。采用免疫熒光顯微鏡直接觀察表明，所篩選到的B*

13、2704/B*2705拮抗肽的噬菌體克隆與正常B細(xì)胞不進(jìn)行結(jié)合，但卻可分別與HLA-B*2704及B*2705細(xì)胞株結(jié)合。流式細(xì)胞術(shù)分析進(jìn)一步顯示，展示有B*2704拮抗肽的噬菌體克隆可與HLA-B*2704細(xì)胞株結(jié)合，陽性率為43.55％；而B*2705拮抗肽噬菌體克隆與HLA-B*2705細(xì)胞株的陽性結(jié)合率為45.69％。上述結(jié)果初步表明，篩選獲得的B27拮抗肽的噬菌體克隆具有一定的親和力，可與表達(dá)于細(xì)胞株表面的B*2704和B*2

14、705分子特異性結(jié)合，而與正常B細(xì)胞不結(jié)合，因而表現(xiàn)出一定的結(jié)合特異性。 總之，本研究成功地建立了HLA-B*2704/B*2705陽性永生化細(xì)胞株，克隆了HLA-B*2704及B*2705全長cDNA，并在原核系統(tǒng)中對其重鏈胞外區(qū)編碼基因進(jìn)行了可溶性的表達(dá)和純化研究，用獲得的重鏈胞外區(qū)蛋白篩選噬菌體隨機(jī)肽庫，初步獲得了HLA-B*2704及B*2705的拮抗肽，并對其表達(dá)情況及生物學(xué)功能進(jìn)行了初步的探索，這為今后深入系統(tǒng)地研究