可溶性HLA-G1-肽復(fù)合物的體外折疊及其對(duì)混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中T細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、人類白細(xì)胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)G基因是1987年由Geraghty等克隆并測序的一類非經(jīng)典HLAⅠ類基因，可通過不同的剪切方式翻譯出七種不同結(jié)構(gòu)的蛋白，包括4種跨膜型和3種可溶性HLA-G(solubleHLA-G，sHLA-G)分子。對(duì)HLA-G的關(guān)注源于母胎耐受。胎兒基因組的一半來自父方，這些基因編碼的產(chǎn)物對(duì)母體而言是同種異體抗原，但正常情況下母體并不對(duì)胎兒的同種異體抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答而導(dǎo)致對(duì)胎兒

2、的排斥。因此，母胎之間必然存在誘導(dǎo)并維持母胎耐受的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，胎盤絨毛膜細(xì)胞不表達(dá)經(jīng)典的HLAⅠ、Ⅱ類分子，卻表達(dá)非經(jīng)典的HLA-G分子。母胎界面上HLA分子表達(dá)的特殊性是導(dǎo)致母胎耐受的重要機(jī)制之一。 對(duì)HLA-G的研究最初集中于跨模型HLA-G1分子。研究證實(shí)，跨膜型HLA-G1分子可直接或間接與NK細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞及巨嗜細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面的殺傷細(xì)胞抑制性受體(killerinhibitoryrecept

3、or,KIR)及ILT(immunoglobulin-liketranscripts/CD85)結(jié)合，激活其胞內(nèi)段的免疫受體酪氨酸抑制基序(Immunologyreceptortyrosine-basedinhibitorymotifITIM)，啟動(dòng)抑制性信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而抑制免疫細(xì)胞的功能，誘導(dǎo)免疫耐受。 在妊娠早期，胎盤所有類型的滋養(yǎng)層細(xì)胞都分泌sHLA-G，母體血中sHLA-G含量與妊娠是否成功相關(guān)：若母體血中sHLA-G

4、含量高，則妊娠易成功；否則，妊娠不易成功。在某些腫瘤、感染、器官移植、自身免疫性疾病病人的血清及組織中檢測到sHLA-G。不表達(dá)膜型HLA-G1的HLA-G*0105N純合型健康個(gè)體能正常妊娠，這些現(xiàn)象提示sHLA-G同樣有著重要的功能。近年來對(duì)sHLA-G生物學(xué)功能研究成為HLA-G研究的新熱點(diǎn)。ContiniP等研究證實(shí)sHLA-G能抑制NK細(xì)胞，CD4+、CD8+T細(xì)胞的功能，但其具體機(jī)制沒有闡明。Fournel等研究表明，純化的

5、HLA-G5可在0.25μg/ml的低濃度下與CD8分子結(jié)合，刺激CD8+細(xì)胞表達(dá)CD95配體，通過Fas/FasL的途徑誘導(dǎo)CD8+細(xì)胞凋亡。而有些研究者在用分泌HLA-G5的細(xì)胞與T細(xì)胞一起孵育時(shí)并沒有觀察到T細(xì)胞的凋亡增加。最近有研究表明HLA-G5可以抑制同種反應(yīng)T細(xì)胞的細(xì)胞周期但不促進(jìn)其凋亡。LeRond等在體外用HLA-G5致敏初始T細(xì)胞18個(gè)小時(shí)，發(fā)現(xiàn)這些處理過的初始T細(xì)胞喪失了對(duì)其后同種抗原刺激的反應(yīng)能力，并能抑制其他T

6、細(xì)胞的反應(yīng)性。在混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中，CD4+、CD8+T細(xì)胞均能表達(dá)可溶性或膜型HLA-G，作為一種負(fù)反饋信號(hào)調(diào)節(jié)CD4+同種反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖。 為闡明sHLA-G的生物學(xué)作用及其作用機(jī)制，有必要獲取大量有功能的sHLA-G分子，真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的可溶性蛋白雖然保持了蛋白原有的構(gòu)象，但不能大量表達(dá)，且純化困難。而原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的包涵體蛋白不能保持蛋白原有的構(gòu)象，也不能進(jìn)行糖基化，因此需在體外進(jìn)行折疊復(fù)性和功能鑒定。本課題研究

7、的目的是采用原核表達(dá)系統(tǒng)，制備大量有功能的sHLA-G1-肽復(fù)合物，并且利用同種異體T細(xì)胞混合培養(yǎng)的方法，觀察體外折疊的sHLA-G1-肽復(fù)合物對(duì)T細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響，為進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制及臨床應(yīng)用奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。我們采用HLA-G限制性的九肽KGPPAALTL與sHLA-G1重鏈及輕鏈在體外經(jīng)稀釋復(fù)性制備sHLA-G1-肽復(fù)合物，并建立同種異體混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系，驗(yàn)證其生物學(xué)功能。本課題的研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 1、sHLA-

8、G1重鏈、β2m的高效表達(dá)和純化 sHLA-G1分子的兩個(gè)亞基sHLA-G1重鏈和β2m(輕鏈)均以包涵體的形式在細(xì)菌內(nèi)高效表達(dá)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，提取包涵體并初步純化后溶于8mol/L尿素中。sHLA-G1重鏈和β2m的蛋白產(chǎn)量分別為180mg/L菌液和150mg/L菌液，灰度掃描純度分別為75.7％及65.8％，能夠滿足本研究制備sHLA-G1-抗原肽復(fù)合物的需要。 2、sHLA-G1-抗原肽復(fù)合物分子的稀

9、釋折疊復(fù)性 在分子結(jié)構(gòu)上，HLA-G1與經(jīng)典的HLAⅠ類分子一樣，均為包括重鏈、輕鏈和抗原肽的三分子復(fù)合物。在HLA-G1限制性的抗原肽存在的情況下，通過稀釋制備得到的β2m與sHLA-G1中的變性劑而實(shí)現(xiàn)體外復(fù)性折疊。來自于胎盤滋養(yǎng)層的九肽KGPPAALTL是從HLA-G上洗脫的三種內(nèi)源性自身肽的一種，它的存在可幫助共折疊形成穩(wěn)定的sHLA-G1-抗原肽復(fù)合物分子。用已知僅與天然構(gòu)象的HLAⅠ類分子結(jié)合的單克隆抗體W6/32進(jìn)

10、行Western-blot鑒定，結(jié)果顯示W(wǎng)6/32同樣能夠結(jié)合于折疊復(fù)合物中的成份，進(jìn)一步應(yīng)用W6/32與抗β2m抗體進(jìn)行雙抗夾心ELISA，證實(shí)體外折疊sHLA-G1-抗原肽復(fù)合物具有HLAⅠ類分子的天然構(gòu)象，說明通過原核表達(dá)、體外折疊能夠成功地制備sHLA-G1單體。 3、sHLA-G1對(duì)混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中T細(xì)胞增殖的影響 外周血淋巴細(xì)胞用羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯(carboxyfluoresceindiace

11、tatesuccinimidylester，CFSE)標(biāo)記后，用同種異體的EB病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴母樣細(xì)胞(EBV-LCL)刺激，此為本實(shí)驗(yàn)的混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系，代表針對(duì)同種異體抗原的T細(xì)胞應(yīng)答。在96孔培養(yǎng)板中加入2×105熒光素標(biāo)記的反應(yīng)細(xì)胞和2×104刺激細(xì)胞，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第一天和第四天加入300μg/mlsHLA-G1-肽復(fù)合物及相同濃度的sHLA-A2-肽復(fù)合物、β2m作為對(duì)照，在第七天再次加入刺激細(xì)

12、胞和蛋白，繼續(xù)培養(yǎng)三天后流式檢測T細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：三個(gè)個(gè)體中，sHLA-G1-肽復(fù)合物實(shí)驗(yàn)組的增殖指數(shù)均明顯低于培養(yǎng)基對(duì)照組(個(gè)體一：5.5266±0.6124vs7.7350±0.4879；個(gè)體二：6.0566±0.4660vs8.9700±0.2353；個(gè)體三：5.8133±0.3470vs7.4600±0.5726；P＜0.05)，而HLA-G的單克隆抗體G11E5+sHLA-G1組與培養(yǎng)基組比較沒有明顯差異(個(gè)體一：7

13、.7050±0.0777vs7.7350±0.4879；個(gè)體二：9.5700±0.5091vs8.9700±0.2353;個(gè)體三：7.200±0.6763vs7.4600±0.5726;P＞0.05)。而sHLA-A2對(duì)照組在個(gè)體一、個(gè)體二中增殖指數(shù)都明顯低于培養(yǎng)基對(duì)照組(個(gè)體一：5.5633±0.3523vs7.7350±0.4879；個(gè)體二：7.0100±0.3111vs8.9700±0.2353；P＜0.05)，而在個(gè)體三中卻高于

14、培養(yǎng)基對(duì)照組(9.0933±0.3859vs7.4600±0.5726；P＜0.05)。這些結(jié)果顯示原核表達(dá)、體外折疊的sHLA-G1能夠抑制T細(xì)胞針對(duì)同種抗原的增殖反應(yīng)。并且這種抑制作用能被針對(duì)HLA-Gα1區(qū)的單克隆抗體G11E5封閉。 可溶性HLA-G是近年來HLA-G研究的一個(gè)新的熱點(diǎn)，在體內(nèi)可能發(fā)揮比膜型HLA-G更為重要的作用。本研究利用原核表達(dá)體系，在體外大量制備正確構(gòu)像的sHLA-G1-肽復(fù)合物，并首次采用CFS