可溶性PD-L1在肺癌微環(huán)境中對(duì)T淋巴細(xì)胞功能影響及其在肺癌患者外周血中的表達(dá)特性.pdf

1、肺癌發(fā)病率和死亡率呈快速上升趨勢(shì)，目前已成為臨床最常見的惡性腫瘤之一，列居各種癌癥死亡的首要原因。腫瘤細(xì)胞通過(guò)免疫逃逸使腫瘤免受宿主防御機(jī)制的殺傷，并不斷進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，協(xié)同刺激分子PD-L1(Programmeddeath-1ligand1，又命名為B7-H1)在包括肺癌的多種人腫瘤細(xì)胞系和實(shí)體腫瘤組織呈高表達(dá)并與腫瘤免疫逃逸相關(guān)。許多協(xié)同刺激分子如OX40、OX40L、CD40L和CTLA-4等除膜型外，還以可溶性的形式存在。臨床研

2、究顯示，有些可溶性協(xié)同刺激分子的表達(dá)水平具有診斷或疾病預(yù)后判斷的價(jià)值，患者腫瘤組織表達(dá)的PD-L1也可用于某些腫瘤臨床療效的參考指標(biāo)。
　　 目前，因缺乏有效的檢測(cè)方法，國(guó)內(nèi)外對(duì)可溶性PD-L1（sPD-L1）的研究報(bào)道尚不多見。健康人機(jī)體內(nèi)是否存在sPD-L1因子，該可溶性因子在腫瘤患者尤其是肺癌患者體內(nèi)表達(dá)水平是否出現(xiàn)異常及其生物學(xué)意義尚無(wú)深入研究，值得進(jìn)一步探討。鑒此，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞表面表達(dá)膜型PD-L

3、1并可以分泌可溶性PD-L1，兩者均可通過(guò)PD-1/PD-L1抑制途徑抑制T淋巴細(xì)胞增殖，發(fā)揮細(xì)胞免疫的負(fù)性調(diào)節(jié)作用；本研究中，我們應(yīng)用蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所自主研發(fā)的特異性人sPD-L1的ELISA體系對(duì)臨床肺癌患者開展深入研究，檢測(cè)臨床肺癌患者sPD-L1分子的表達(dá)特性，分析其各項(xiàng)臨床診斷指標(biāo)的相關(guān)性，揭示該因子的表達(dá)水平與肺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，探討sPD-L1是否可以作為肺癌患者臨床診斷、療效預(yù)測(cè)和預(yù)后判斷的依據(jù)，以PD-L1

4、為作用靶點(diǎn)，為肺癌的臨床治療提供一種新的免疫干預(yù)手段。
　　 一、可溶性PD-L1在肺癌環(huán)境下通過(guò)PD-1/PD-L1抑制途徑對(duì)T淋巴細(xì)胞功能的影響
　　 [目的]分析sPD-L1在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)特性并探討其通過(guò)PD-1/PD-L1抑制途徑對(duì)人T淋巴細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響。
　　 [方法]應(yīng)用單克隆抗體標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)肺癌細(xì)胞表面PD-L1分子和人外周血T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)特性，通過(guò)ELISA法檢測(cè)肺癌細(xì)

5、胞分泌的可溶sPD-L1的表達(dá)，應(yīng)用CCK-8摻入法體外研究膜型和可溶性PD-L1對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　 [結(jié)果]人外周血靜止性T細(xì)胞低表達(dá)或不表達(dá)PD-1分子，而活化T細(xì)胞表面則上調(diào)表達(dá)PD-1分子；細(xì)胞表面組成性表達(dá)PD-L1分子的肺癌細(xì)胞株均能產(chǎn)生sPD-L1；表達(dá)PD-L1的肺癌細(xì)胞能通過(guò)PD-1/PD-L1信號(hào)抑制T淋巴細(xì)胞的增殖和活化(P＜0.05)；其培養(yǎng)上清對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖具有一定的抑制效應(yīng)(P＜0.0

6、5)；特異性阻斷該抑制信號(hào)在一定程度上可以恢復(fù)T淋巴細(xì)胞的增殖活性。
　　 [結(jié)論]肺癌細(xì)胞表面表達(dá)膜型PD-L1并可以分泌可溶性PD-L1，兩者均可抑制T淋巴細(xì)胞增殖，發(fā)揮細(xì)胞免疫的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，這可能使腫瘤抗原特異性T淋巴細(xì)胞不能及時(shí)活化并清除腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致肺癌細(xì)胞產(chǎn)生免疫逃逸。
　　 二、肺癌患者外周血可溶性PD-L1表達(dá)水平及其臨床意義
　　 [目的]檢測(cè)肺癌患者血清中可溶性程序性死亡配體-1(sPD-L

7、1)的表達(dá)水平并探討其臨床意義。
　　 [方法]篩選2009年6月至2011年3月蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸科肺癌患者，共入選患者81例，其中男55例，女26例，年齡34～87歲，平均（65±6）歲。所有肺癌患者均為初診且經(jīng)組織或細(xì)胞病理學(xué)確診；以88例性別、年齡匹配的健康體檢者作為對(duì)照組，收集上述人群外周血清并記錄肺癌患者的臨床資料。采用Western-blot方法和酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測(cè)上述人員血清中sPD-L1的

8、表達(dá)特性；免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)上述人群CD4+PD-1+T細(xì)胞、CD8+PD-1+T細(xì)胞及CD14+單核細(xì)胞PD-L1的變化。
　　 [結(jié)果]肺癌患者外周血存在sPD-L1分子的表達(dá)，其水平為(2.04±1.42)ng/ml，明顯高于健康人外周血中該因子的含量(1.04士0.67)ng/ml，(P＜0.001)；肺癌患者血清中sPD-L1的異常高表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度和有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。雙色熒光標(biāo)記標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肺癌患者外

9、周血T細(xì)胞亞群中CD4+PD-1+、CD8+PD-1+百分率(P＜0.05)均增高，同時(shí)，檢測(cè)到單核細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)水平也明顯增加(P＜0.05)。連續(xù)采樣檢測(cè)治療前后外周血CD4+T和CD8+T細(xì)胞上PD-1表達(dá)水平和CD14+單核細(xì)胞上PD-L1表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果顯示，療效明顯患者CD4+T和CD8+T細(xì)胞上PD-1和單核細(xì)胞上PD-L1水平雖仍較健康者偏高，但較肺癌患者平均水平明顯減低，而療效不顯著甚至進(jìn)展肺癌患者T淋

10、巴細(xì)胞表面PD-1表達(dá)則較平均水平進(jìn)一步升高(P＜0.05)。
　　 [結(jié)論]肺癌患者外周血清中sPD-L1的表達(dá)異常增高，且與肺癌的分期、轉(zhuǎn)移和療效有關(guān)，在個(gè)體化治療中有助于肺癌患者的預(yù)后判斷，可能成為重要的抗腫瘤靶點(diǎn)及分子標(biāo)志物；肺癌患者外周血T細(xì)胞和單核細(xì)胞上也存在PD-1和PD-L1的異常表達(dá)，提示PD-1/PD-L1信號(hào)在T細(xì)胞與單核細(xì)胞相互作用過(guò)程中可能抑制T細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致肺癌細(xì)胞逃脫T細(xì)胞殺傷，參與疾病的發(fā)生發(fā)

11、展。
　　 綜上所述，本課題研究獲得了以下研究結(jié)果：(1)組成性表達(dá)PD-L1分子的肺癌細(xì)胞株均能產(chǎn)生sPD-L1；在體外T細(xì)胞共培養(yǎng)體系中可以抑制T淋巴細(xì)胞的增殖，通過(guò)PD-L1阻斷型單抗可以部分恢復(fù)T細(xì)胞增殖的能力。提示肺癌細(xì)胞表面的PD-L1系通過(guò)和激活的T細(xì)胞膜表面的PD-1結(jié)合而產(chǎn)生負(fù)性免疫調(diào)控作用。(2)利用自主研發(fā)的sPD-L1ELISA試劑盒，發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清中存在sPD-L1高表達(dá)，且這種高表達(dá)和肺癌的分期和淋