永生化骨骺干細(xì)胞株的建立及PTHrP亞基因?qū)趋扛杉?xì)胞增殖和分化的影響.pdf

1、目的：體外分離、培養(yǎng)、鑒定骨骺干細(xì)胞并誘導(dǎo)其永生化，建立高水平誘導(dǎo)、低背景表達(dá)的骨骺干細(xì)胞株，研究甲狀旁腺相關(guān)蛋白亞基因PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)對體外培養(yǎng)的骨骺干細(xì)胞的調(diào)控作用以及PTHrP(107-139)與其他調(diào)控因子的相互影響。
　　 方法：采用顯微取材和免疫磁性分選技術(shù)分離純化具有成纖維生長因子受體-3（fibroblast growth factor recepto

2、r-3，F(xiàn)GFR-3）特異性表面標(biāo)志的骨骺干細(xì)胞。利用電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)將含有猿腎病毒40大T抗原基因（SV40Tag）的質(zhì)粒pCMVSV40T/PUR轉(zhuǎn)染骨骺干細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選，抗性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)獲得永生化骨骺干細(xì)胞。提取骨骺干細(xì)胞的總RNA，以RT-PCR方法獲得帶有酶切位點(diǎn)的PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)基因片段，擴(kuò)增的DNA片段分別與載體pTRE-2Hyg雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后對重

3、組質(zhì)粒進(jìn)行提取和酶切、測序鑒定。用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將pTet-on質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于骨骺干細(xì)胞，G418篩選得到穩(wěn)定克隆，再瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pTRE-2Hyg-Luc質(zhì)粒并篩選出高水平誘導(dǎo)、低背景表達(dá)的pTet-on骨骺干細(xì)胞系。用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將將質(zhì)粒pTRE-PTHrP(1-36)、pTRE-PTHrP(38-94)和pTRE-PTHrP(107-139)分別轉(zhuǎn)染高水平誘導(dǎo)、低背景表達(dá)的-pTet-on骨骺干細(xì)胞株，放入誘導(dǎo)分化培

4、養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，加入強(qiáng)力霉素進(jìn)行誘導(dǎo)，以RT-PCR的方法檢測PCNA基因的表達(dá)變化。應(yīng)用RT-PCR的方法檢測不同濃度的強(qiáng)力霉素下質(zhì)粒pTRE-PTHrP(107-139)轉(zhuǎn)染組的ColⅡ、Col Ⅹ、Ihh、Ptc、Sox9、BMP6基因的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)所取材分離并純化的細(xì)胞為骨骺干細(xì)胞。SV40Tag穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入骨骺干細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，命名為永生化骨骺干細(xì)胞。從骨骺干細(xì)胞中克隆出的PTHrP亞克隆基

5、因PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)經(jīng)酶切圖譜分析和DNA序列測定證實(shí)已經(jīng)插入重組質(zhì)粒pTRE-PTHrP(1-36)、pTRE-PTHrP(38-94)和pTRE-PTHrP(107-139)。pTet-on質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于骨骺干細(xì)胞，并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pTRE-2Hyg-Luc質(zhì)粒獲得1株誘導(dǎo)后熒光素酶的表達(dá)活性增加50倍的pTet-on骨骺干細(xì)胞株。強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的質(zhì)粒pTRE-PTHrP(107-13

6、9)轉(zhuǎn)染組的PCNA表達(dá)明顯高于質(zhì)粒pTRE-PTHrP(1-36)轉(zhuǎn)染組和質(zhì)粒pTRE-PTHrP(38-94)轉(zhuǎn)染組；在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的質(zhì)粒pTRE-PTHrP(107-139)轉(zhuǎn)染組中ColⅡ、Sox-9表達(dá)明顯增強(qiáng)，Ihh表達(dá)未見明顯變化，而 Ptc、Col Ⅹ、BMP6表達(dá)明顯降低。而且其表達(dá)量與強(qiáng)力霉素存在劑量依賴性。
　　 結(jié)論：運(yùn)用顯微取材和免疫純化技術(shù)可以成功分離純化骨骺干細(xì)胞。經(jīng)SV40Tag轉(zhuǎn)染構(gòu)建了永生化的

7、骨骺干細(xì)胞株。成功克隆出PTHrP亞克隆基因PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)并構(gòu)建了反應(yīng)質(zhì)粒pTRE-PTHrP(1-36)、pTRE-PTHrP(38-94)和pTRE-PTHrP(107-139)。篩選得到的pTet-on骨骺干細(xì)胞株受強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)后能夠低背景、高水平表達(dá)。PTHrP(107-139)可能是通過調(diào)控Sox-9、Ptc、BMP6的表達(dá)來促進(jìn)骨骺干細(xì)胞增殖并抑制其分化的，而P