低強(qiáng)度脈沖超聲波對大鼠脂肪干細(xì)胞增殖和成骨分化的影響及成骨機(jī)制的初步研究.pdf

1、本文內(nèi)容主要分為四部分：
　　第一部分SD大鼠ADSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　目的：從 SD大鼠脂肪組織中分離得到間質(zhì)干細(xì)胞,為后續(xù)研究提供種子細(xì)胞。
　　方法：
　　1.從 SD大鼠的腹股溝部位切取脂肪組織,結(jié)合酶消化法獲得一群細(xì)胞。
　　2.經(jīng)免疫磁珠系統(tǒng)分選后體外培養(yǎng),觀測其形態(tài)學(xué)特征及鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記。
　　結(jié)果：
　　1.獲取的細(xì)胞呈現(xiàn)類成纖維細(xì)胞樣,可在體外穩(wěn)定擴(kuò)增傳代。
　

2、　2.獲取的細(xì)胞表面標(biāo)志符合目前公認(rèn)的間質(zhì)干細(xì)胞表型特征。
　　結(jié)論：通過機(jī)械分離結(jié)合酶消化的方法,經(jīng)分選后成功獲得 SD大鼠ADSCs,可體外培養(yǎng),為后續(xù)研究提供種子細(xì)胞。
　　第二部分LIPUS對大鼠ADSCs增殖和成骨分化的影響
　　目的：探討 LIPUS對體外分離培養(yǎng)的大鼠ADSCs增殖及成骨分化的影響。
　　方法：
　　1.流式細(xì)胞儀檢測陰性對照組和LIPUS組中1d、2d、3d、4d和5d時(shí) A

3、DSCs細(xì)胞周期分布,計(jì)算增殖指數(shù)。
　　2.CCK-8法檢測陰性對照組和LIPUS組1d、3d、5d和7d時(shí)細(xì)胞計(jì)數(shù),比較增殖程度。
　　3.設(shè)置陰性對照組、LIPUS組、成骨誘導(dǎo)組及LIPUS聯(lián)合成骨誘導(dǎo)組,于 LIPUS刺激7d、14d時(shí)測定各組細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性;于 LIPUS刺激21d時(shí)采用Von kossa染色比較各組鈣結(jié)節(jié)形成。
　　4.RT-PCR檢測陰性對照組和LIPUS組1d、3d、5d和

4、7d時(shí)成骨相關(guān)基因(包括Runx2、ALP、OCN、BSP、Coll I)的表達(dá)。
　　5.Western blot檢測陰性對照組和LIPUS組7d和14d時(shí)成骨相關(guān)蛋白(包括 Runx2和BSP)的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.LIPUS組細(xì)胞增殖指數(shù)4d和5d時(shí)較對照組提高。
　　2.LIPUS組細(xì)胞增殖程度3d、5d和7d時(shí)較對照組加快。
　　3.LIPUS組 ALP活性7d或14d時(shí)較對照組提高,但低

5、于成骨誘導(dǎo)組及LIPUS聯(lián)合成骨誘導(dǎo)組;成骨誘導(dǎo)組與 LIPUS聯(lián)合成骨誘導(dǎo)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;另外各組細(xì)胞 ALP活性測定結(jié)果在上述2個(gè)時(shí)間點(diǎn)間組內(nèi)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LIPUS作用能致 ADSCs形成礦化結(jié)節(jié),但其礦化結(jié)節(jié)數(shù)量不及成骨誘導(dǎo)組和LIPUS聯(lián)合成骨誘導(dǎo)組。
　　4.LIPUS組3d、5d或7d后,Runx2和ALP mRNA的表達(dá)增加;5d或7d后, LIPUS組 BSP和OCN mRNA也表達(dá)增加;沒有觀察到

6、Coll I mRNA的改變。
　　5.LIPUS作用7d和14d后,Runx2和BSP蛋白表達(dá)量均增加,BSP蛋白表達(dá)的增加從7d維持到14d。但14d后 Runx2蛋白量較7d時(shí)稍有下調(diào)。
　　結(jié)論：LIPUS能加速大鼠ADSCs增殖,促進(jìn)大鼠ADSCs向成骨細(xì)胞分化。
　　第三部分β-catenin shRNA慢病毒載體構(gòu)建和沉默β-catenin基因效果檢測
　　目的：構(gòu)建慢病毒載體,沉默大鼠脂肪源干細(xì)胞

7、β-catenin基因表達(dá),為分析經(jīng)典的Wnt通路在 LIPUS促進(jìn)大鼠ADSCs成骨分化中的作用提供基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.針對大鼠ADSCs的β-catenin基因設(shè)計(jì)出3種 shRNA打靶序列,分別構(gòu)建3種 pCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi質(zhì)粒載體,轉(zhuǎn)染至大鼠ADSCs,篩選出最有效的shRNA打靶序列。
　　2.構(gòu)建含有該 shRNA序列的慢病毒載體。
　　3.用慢病毒載體轉(zhuǎn)染

8、大鼠ADSCs。
　　4.檢測慢病毒載體轉(zhuǎn)染后,沉默β-catenin基因的效果。
　　結(jié)果：
　　1.用質(zhì)粒載體篩選出有效的β-catenin基因 shRNA序列。
　　2.用構(gòu)建病毒載體轉(zhuǎn)染大鼠ADSCs后,可有效沉默β-catenin基因。
　　結(jié)論：一種較為經(jīng)濟(jì)的方法,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,沉默大鼠脂肪源干細(xì)胞β-catenin基因。藉此可分析經(jīng)典的Wnt通路在 LIPUS促進(jìn)大鼠ADSCs成骨分化中的作用。<

9、br>　　第四部分經(jīng)典 Wnt信號通路在 LIPUS促進(jìn)大鼠ADSCs成骨分化中的作用
　　目的：初步探討經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路在 LIPUS促進(jìn)大鼠ADSCs成骨分化過程中的作用。
　　方法：
　　1.Real-time PCR檢測正常 ADSCs組、未轉(zhuǎn)染刺激組、轉(zhuǎn)染刺激組1d、3d、5d和7d時(shí)成骨相關(guān)基因(包括 Runx2、ALP、BSP、Coll I)的表達(dá);
　　2.Western

10、blot檢測正常 ADSCs組、未轉(zhuǎn)染刺激組、轉(zhuǎn)染刺激組7d和14d時(shí)成骨相關(guān)蛋白(包括 Runx2和BSP)的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.正常的ADSCs在不接受 LIPUS刺激的情況下,所有基因基本呈現(xiàn)一致表達(dá)。
　　2.未轉(zhuǎn)染刺激組3d、5d和7d后 Runx2基因的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào);轉(zhuǎn)染刺激組3d、5d和7d后 Runx2基因的表達(dá)也同樣出現(xiàn)上調(diào),但上調(diào)的幅度下降。
　　3.未轉(zhuǎn)染刺激組3d、5d和7d后出現(xiàn)

11、 ALP基因表達(dá)的上調(diào);轉(zhuǎn)染刺激組3d、5d和7d后也同樣出現(xiàn)較一致的上調(diào),上調(diào)的幅度無下降。
　　4.未轉(zhuǎn)染刺激組5d和7d后出現(xiàn) BSP基因的上調(diào)表達(dá);轉(zhuǎn)染刺激組5d和7d后也同樣出現(xiàn)上調(diào),但上調(diào)的幅度有所下降。
　　5.而三組之間,I型膠原基因的表達(dá)始終沒有明顯的變化。
　　6.未轉(zhuǎn)染刺激組和轉(zhuǎn)染刺激組在7d和14d后,均出現(xiàn) Runx2蛋白的表達(dá)水平增加,但14d后增幅稍低;轉(zhuǎn)染刺激組與未轉(zhuǎn)染刺激組相比,7d時(shí)