IFN-γ對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖、遷移和成牙-成骨向分化能力的影響及其相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、牙髓是牙齒中唯一的軟組織，位于由牙本質(zhì)圍成的牙髓腔內(nèi)。牙髓組織在外界物理、化學(xué)或細(xì)菌等因素刺激下可發(fā)生炎癥性損傷。牙髓炎癥發(fā)生時(shí)牙髓組織中多種炎癥因子、趨化因子聚集，同時(shí)各種免疫細(xì)胞被激活參與調(diào)控炎癥反應(yīng)。Hahn等研究表明，牙髓炎發(fā)生時(shí)牙髓組織中的淋巴細(xì)胞明顯高于正常牙髓組織['包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等，同時(shí)TNF-a、IL-1]3、IL-2、IFN-γ和IL-8等炎癥因子表達(dá)水平上調(diào)[2]。
　　干擾素-γ(in

2、terferon，IFN-γ)是免疫反應(yīng)中重要的免疫調(diào)節(jié)因子。研究表明，IFN-γ在較淺的齲壞導(dǎo)致的早期慢性牙髓炎中占主導(dǎo)地位[3];當(dāng)齲壞加深時(shí)，IFN-γ仍然存在于牙髓炎癥反應(yīng)中。IFN-γ與模式識(shí)別受體（pattem recognition receptor，PRR)配體協(xié)同作用可以促進(jìn)人牙髓細(xì)胞分泌促炎因子C X C L10和 IL-6[4]。Sonoda等通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ可以修復(fù)不可逆性牙髓炎來源的DPSCs的牙

3、本質(zhì)形成能力[5]。還有研究表明，IFN-γ預(yù)刺激人牙髓干細(xì)胞，可以促進(jìn)與其共培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移能力[6]。以上研究結(jié)果表明，I F N-γ不僅在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要促炎作用，在牙髓組織的損傷修復(fù)中也發(fā)揮不可或缺的作用。
　　DPSCs(dental pulp stem cells，DPSCs)是位于牙髓組織中未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有高度的自我更新能力和多向分化潛能，首次由Gronthos等從人的第三磨牙分離得出[7]。

4、DPSCs在不同的誘導(dǎo)微環(huán)境中可以分化為成牙、成骨、成軟骨、成脂肪、成神經(jīng)等細(xì)胞[8]。DPSCs取材于正畸減數(shù)拔除的恒牙，取材方便，廣泛用于組織損傷修復(fù)研究。有研究表明礦化液體外誘導(dǎo)DPSCsM天可以形成礦化結(jié)節(jié)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)DPSCs可以形成類牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)[9]。
　　在牙髓炎癥的早期或者牙髓炎的可復(fù)性階段，DPSCs增殖、遷移、分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，在臨近刺激的牙本質(zhì)近髓側(cè)形成修復(fù)性牙本質(zhì)，抵御外界刺激。DPSCs的增殖、

5、遷移和成牙/成骨向分化涉及了牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體抵御外來刺激的一個(gè)連續(xù)的細(xì)胞生命活動(dòng)，三種生命活動(dòng)缺一不可。
　　本課題旨在構(gòu)建較純化的DPSCs細(xì)胞系，通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)研究IFN-γ對(duì)人牙髓細(xì)胞增殖、遷移和成牙/成骨向分化能力的影響，并探討IFN-γ影響人牙髓干細(xì)胞成牙/成骨向分化的分子機(jī)制，為牙髓組織的損傷修復(fù)提供新線索。主要研究成果如下：
　　一、人牙髓干細(xì)胞系的成功建立
　　我們選取18周歲以下年輕患者因正畸或阻生

6、拔除的恒牙，取其新鮮牙髓組織，用組織塊聯(lián)合酶消化法獲得原代培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞。用有限稀釋法挑選具有克隆形成能力的DPSCs，擴(kuò)大培養(yǎng)。經(jīng)流式細(xì)胞儀分析鑒定我們獲得了表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志的DPSCs。礦化誘導(dǎo)液培養(yǎng)該細(xì)胞可以形成茜素紅染色陽(yáng)性的礦化結(jié)節(jié)；成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)該細(xì)胞可以形成油紅O染色陽(yáng)性的脂滴結(jié)構(gòu)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明我們獲得了較純化的人牙髓干細(xì)胞系。
　　二、IFN^可以促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞的增殖能力
　　我們用含IFN-γ

7、O、0.05、0.5、5、50和500 ng/m L的培養(yǎng)液刺激人牙髓干細(xì)胞，用MTT實(shí)驗(yàn)和EdU實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)DPSCs的增殖活力。結(jié)果顯示，IFN-γ0.05、0.5和5ng/mL組均上調(diào)了 DPSCs的增殖活力。同時(shí)用RT-PCR檢測(cè)DPSCs細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。RT-PCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組PCNA、cγclin B l、cγclin D l的表達(dá)上調(diào)， P21表達(dá)水平下調(diào)。即體外實(shí)驗(yàn)研究表明IFN-γ可以促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞的增

8、殖能力。
　　三、IFN吖可以促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞的遷移能力
　　我們用不同濃度的IFN-γ刺激人牙髓干細(xì)胞，用Tmnswell和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IFN-γ對(duì)人牙髓干細(xì)胞遷移能力的影響。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IFN-γ組遷移的細(xì)胞數(shù)目明顯高于對(duì)照組。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果。即體外實(shí)驗(yàn)研究表明IFN-γ促進(jìn)了人牙髓干細(xì)胞的遷移能力。
　　四、抑制人牙髓干細(xì)胞的成牙/成骨向分化，NF-KB和MAPK信號(hào)

9、通路可能參與其中
　　我們首先用含不同濃度IFN-γ的礦化液在體外誘導(dǎo)人牙髓干細(xì)胞兩周，做茜素紅染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其礦化結(jié)節(jié)形成能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IFN-γ抑制了人牙髓干細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)形成能力。在礦化誘導(dǎo)液中加入信號(hào)通路抑制劑(PDTC、SB203580、U0126或SP600125)，同時(shí)加或不加IFN-γ，做茜素紅染色和WestemBlot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)DPSCs的成牙/成骨向分化能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PDTC和 SB203580組DPS

10、Cs礦化結(jié)節(jié)形成能力和成骨相關(guān)蛋白表達(dá)水平均明顯高于IFN-γ組。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們IFN-γ可能通過NF-KB和MAPK信號(hào)通路抑制了DPSCs的成牙/成骨向分化能力。
　　然后，我們檢測(cè)了NF-KB和MAPK信號(hào)通路中信號(hào)蛋白的磷酸化水平變化。Westem Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示P65的磷酸化水平隨IFN-γ刺激時(shí)間延長(zhǎng)逐漸被上調(diào)，PDTC的加入下調(diào)了P65的磷酸化水平；P38的磷酸化水平被下調(diào)，當(dāng)加入通路抑制劑SB20358

11、0后，該磷酸化水平被上調(diào)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們，IFN-γ可能通過激活P65，抑制P38的磷酸化水平，介導(dǎo)其對(duì)DPSCs成牙/成骨向分化的抑制作用。
　　其次，我們將人牙髓干細(xì)胞與仿生多孔納米纖維凝膠支架材料復(fù)合，用含或不含IFN-γ及通路抑制劑的礦化誘導(dǎo)液體外預(yù)培養(yǎng)1周，無菌條件下移植到裸鼠皮下。Micro-CT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IFN-γ抑制了礦化組織的形成，而抑制劑組逆轉(zhuǎn)了這一效果。HE染色顯示，所有組別均有類牙髓樣軟組織形成，

12、并充滿于支架材料的孔隙中。Masson染色和Vkn Gieson染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IFN-γ組形成的類牙本質(zhì)樣組織明顯低于對(duì)照組，且當(dāng)加入NF-KB通路抑制劑PDTC或者M(jìn)APK/P38的抑制劑SB203580后，明顯促進(jìn)了DPSCs的類牙本質(zhì)樣組織形成能力。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相一致，進(jìn)一步提示我們IFN-γ可能通過NF-KB/P65和MAPK/P38信號(hào)通路抑制人牙髓干細(xì)胞的成牙/成骨向分化能力。
　　綜上所述，我們