當(dāng)歸多糖對(duì)人牙髓細(xì)胞增殖和成骨方向誘導(dǎo)分化的影響.pdf

1、目的:本試驗(yàn)采用體外培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞的方法建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究?dāng)歸多糖(Angelica Polysaccharides，APS)對(duì)體外分離培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞增殖與成骨方向分化的影響。
　　方法:
　　1牙髓細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定:取正畸或阻生拔除的健康年輕恒牙，運(yùn)用改良組織塊培養(yǎng)法獲得體外人牙髓原代細(xì)胞并常規(guī)傳代;取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3-5代人牙髓細(xì)胞進(jìn)行爬片，按SP試劑盒說(shuō)明書(shū)用SABC法進(jìn)行波形絲蛋白和角蛋白的免疫組化染色，于倒置

2、顯微鏡下觀察。
　　2牙髓細(xì)胞增殖活性檢測(cè):
　　2.1Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖活性:
　　取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3-5代人牙髓細(xì)胞以2×104cells/ml的細(xì)胞濃度分別接種于5個(gè)96孔培養(yǎng)板內(nèi)，將這5組細(xì)胞隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別加入含1％胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)液配制的四個(gè)不同濃度的當(dāng)歸多糖(50、100、200、400μ moL/l);

3、對(duì)照組加入含1％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，每孔加液量為200微升，每板余出一列培養(yǎng)孔不加液（作為空白對(duì)照組）。分別于培養(yǎng)后的第3、6、12、24、48h棄去96孔板內(nèi)原液體，加入110μl經(jīng)純DMEM培養(yǎng)液稀釋后的CCK-8（DMEM和CCK-8的濃度配比為10∶1），隨后重新置入37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培育2h，以空白對(duì)照孔調(diào)零，取出后在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm波長(zhǎng)下各孔的吸光度值(A450)。
　　3牙髓細(xì)胞成骨方向分化能力檢測(cè)

4、:
　　3.1Ⅰ型膠原(CollⅠ)的表達(dá):
　　取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3-5代人牙髓細(xì)胞，0.25％胰蛋白酶消化后，按照2×104cells/ml的細(xì)胞濃度接種于25ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶3ml，共8瓶。將這8組細(xì)胞隨機(jī)分為4個(gè)對(duì)照組和4個(gè)加藥組，分別于培養(yǎng)后的第3、6、12、24h用PBS清洗3遍，加入Trizol試劑1ml，反復(fù)吹打待細(xì)胞完全溶解后，收集瓶?jī)?nèi)液體于無(wú)酶EP管中，置于-80℃冰箱保存。由北京賽百盛基因有限技術(shù)公

5、司合成Ⅰ型膠原(CollⅠ)引物，并檢測(cè)該基因的表達(dá)。
　　3.2ALP活性表達(dá):
　　取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3-5代人牙髓細(xì)胞以2×104cells/ml的細(xì)胞濃度分別接種于5個(gè)96孔培養(yǎng)板內(nèi)，將這5組細(xì)胞隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別加入含1％ FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液配制的四個(gè)不同濃度的當(dāng)歸多糖(50、100、200、400μmoL/l);對(duì)照組加入含1％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，每孔加液量為200微升，

6、每板余出一列培養(yǎng)孔不加液（作為空白對(duì)照組）。分別于培養(yǎng)后的第6、12、24、48、72h棄去96孔板內(nèi)原液體，經(jīng)PBS緩沖液反復(fù)清洗3次并吸干后，每孔分別加入50μ l0.1％ TritonX-100，于4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜。次日，按照ALP試劑盒說(shuō)明書(shū)加入底物，每孔加入量為100μl，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培育30min后取出，每孔分別加入0.2mol/L NaOH50μl終止反應(yīng)，以空白對(duì)照孔調(diào)零，取出后在酶標(biāo)儀上測(cè)定410nm波長(zhǎng)下

7、各孔的吸光度值(A410)。
　　3.3骨鈣素(osteocalcin，OC)合成的表達(dá):
　　取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3-5代人牙髓細(xì)胞，0.25％胰蛋白酶消化后，按照2×104cells/ml的細(xì)胞濃度接種于25ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶3ml，共14瓶。將這14組細(xì)胞隨機(jī)分為7個(gè)對(duì)照組和7個(gè)加藥組，分別于培養(yǎng)后的第1、3、5、7、9、11、13天后用PBS清洗3遍，加入Trizol試劑1ml，反復(fù)吹打待細(xì)胞完全溶解后，收集瓶?jī)?nèi)液體

8、于無(wú)酶EP管中，置于-80℃冰箱保存。由北京賽百盛基因有限技術(shù)公司合成OC引物，并檢測(cè)該基因的表達(dá)。
　　3.4礦化結(jié)節(jié)形成的觀察:
　　茜素紅染色:取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3-5代人牙髓細(xì)胞，0.25％胰蛋白酶消化后，按照2×104cells/ml的細(xì)胞濃度接種于6孔板中，分為未誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，隔日換液。分別在培養(yǎng)后的第7、14、28天，取出6孔板，PBS清洗3遍，用4％甲醛溶液固定約10～15min后，PBS

9、再次清洗3遍，隨后以1％茜素紅染色10min，反復(fù)蒸餾水清洗，直至吸出液體呈無(wú)色透明狀。倒置相差顯微鏡下觀察、拍片記錄其變化過(guò)程。
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件作單因素方差分析，采用S-N-K法進(jìn)行多重比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.體外培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞來(lái)源鑒定:體外分離培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞經(jīng)免疫組化染色結(jié)果為波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)，角蛋白陰性表達(dá)，

10、證實(shí)該細(xì)胞來(lái)源于中胚層間充質(zhì)細(xì)胞，與實(shí)驗(yàn)要求相一致。
　　2.當(dāng)歸多糖對(duì)牙髓細(xì)胞增殖能力的影響:與對(duì)照組相比，在一定的濃度范圍內(nèi)，當(dāng)歸多糖可以促進(jìn)牙髓細(xì)胞的增殖，并在作用時(shí)間為12h，藥物濃度為200μmoL/l時(shí)可達(dá)到其作用峰值。
　　3.當(dāng)歸多糖對(duì)牙髓細(xì)胞成骨方向分化的各個(gè)時(shí)期都具有一定的促進(jìn)作用。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)當(dāng)歸多糖對(duì)人牙髓細(xì)胞的增殖和成骨方向分化均有一定的促進(jìn)作用，且與作用時(shí)間以及藥物