BMP2與DXM對人牙髓細(xì)胞增殖和分化的影響.pdf

1、牙髓細(xì)胞(hDPCs)具有自我復(fù)制更新和多向分化克隆的潛能，可在生物因子的作用下可以向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化。骨形態(tài)發(fā)生蛋-2（BMP-2）和地塞米松(DXM)是常見的成骨誘導(dǎo)因子，可以使牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化。在成牙本質(zhì)細(xì)胞形成過程中亦發(fā)揮著重要作用。本研究的目的為探討B(tài)MP-2和DXM在誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞增殖和牙向分化的作用以及兩者聯(lián)合運用是否能增強誘導(dǎo)效果，為牙髓細(xì)胞分化的實驗提供生物因子優(yōu)化組合的實驗依據(jù)。
　　目的:

2、>　　1、建立hDPCs培養(yǎng)模型，體外分離并培養(yǎng)hDPCs，鑒定細(xì)胞來源。
　　2、探討B(tài)MP-2和DXM以及兩者聯(lián)合作用礦化及誘導(dǎo)hDPCs體外增殖及向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的影響。
　　方法:
　　1、hDPCs的體外分離、培養(yǎng)及鑒定:收集我院外科門診15-30周歲患者無牙體牙髓牙周疾病的正畸牙或智齒，半小時之內(nèi)迅速至無菌條件下劈開牙體取出髓腔中牙髓組織，并將其剪成1mm3小塊，置于培養(yǎng)瓶中，加入含20％優(yōu)質(zhì)胎牛血清的高

3、糖DMEM培養(yǎng)液，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)置條件為37℃、5％ CO2濃度。待細(xì)胞生長融合至25cm3培養(yǎng)瓶瓶底80％后，用無菌巴氏吸管加入0.25％胰酶，消化傳代細(xì)胞。取生長狀態(tài)良好的第3-5代細(xì)胞行波形蛋白和角蛋白免疫化學(xué)染色鑒定。凍存穩(wěn)定傳代的3-6代hDPCs待用。
　　2、BMP-2和DXM分別及聯(lián)合作用對hDPCs增殖的影響:用濃度為BMP-2(100ng/ml)、DXM(1×10-8mol/1)、BMP-2(100ng

4、/ml)+DXM(1×10-8mol/1)誘導(dǎo)穩(wěn)定傳代的hDPCs，與對照組比較（僅含10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液），在1day、3day、5day、7day消化細(xì)胞，制成細(xì)胞懸濁液，計數(shù)，繪制各組細(xì)胞生長曲線。
　　3、BMP-2和DXM分別及聯(lián)合作用對hDPC向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的影響:誘導(dǎo)步驟同上，利用RT-PCR檢測BMP-2和DXM分別及聯(lián)合作用5day、7day后成牙本質(zhì)標(biāo)記基因DSPP、ALP、DMP-1的表達(dá)。作

5、用14day后進(jìn)行堿性磷酸酶染色檢測ALP活性。作用21day，進(jìn)行茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色，定量檢測礦化結(jié)節(jié)分析成牙本質(zhì)分化情況。
　　結(jié)果:
　　1、hDPCs的體外分離、培養(yǎng)及鑒定:(1)培養(yǎng)3-5天后，可見有梭型纖維狀細(xì)胞爬出，7天左右細(xì)胞密集生長融合至瓶底的80％，可穩(wěn)定傳代，保持一定生長能力。(3)經(jīng)波形蛋白、角蛋白免疫化學(xué)染色可見，細(xì)胞波形蛋白陽性表達(dá)，角蛋白陰性表達(dá)，說明培養(yǎng)的細(xì)胞來源于間葉組織中胚層，符合牙髓細(xì)胞

6、的生物學(xué)特征。
　　2、BMP-2和DXM分別及聯(lián)合作用對hDPCs增殖的影響:隨培養(yǎng)時間延長，各組細(xì)胞數(shù)均逐漸增加，5d時達(dá)峰值，后逐漸下降，7d降至3d時水平。培養(yǎng)1d時，各組細(xì)胞數(shù)無明顯差異(P＞0.05);培養(yǎng)3d時BMP-2組、BMP-2+DXM組細(xì)胞數(shù)顯著高于DXM、對照組(P＜O.05) BMP-2組、BMP-2+DXM組間無明顯差異，DXM組、對照組間無明顯差異(P＞O.05);5 d時BMP-2、DXM、BMP-

7、2+DXM組細(xì)胞數(shù)顯著高于對照組，BMP-2+DXM組＞BMP-2組＞DXM組＞對照組(P＜0.05);7d時細(xì)胞數(shù)下降，BMP-2+DXM組＞BMP-2組＞對照組＞DXM組(P＜0.05)。
　　3、BMP-2和DXM分別及聯(lián)合作用對hDPCs分化的影響:經(jīng)誘導(dǎo)后各處組的成牙本質(zhì)形成標(biāo)記基因DSPP、DMP-1、ALP均有表達(dá)，堿性磷酸酶染色染色陽性，礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色陽性，說明牙髓細(xì)胞可以在BMP-2、DXM的誘導(dǎo)下分化為成牙

8、本質(zhì)細(xì)胞，RT-PCR檢測示，經(jīng)誘導(dǎo)5d，BMP-2、DXM、BMP-2+DXM組細(xì)胞的ALP、DSPP、DMP-1表達(dá)較對照組均上調(diào)，其中BMP-2+DXM組表達(dá)最高。BMP-2組與DXM組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），與BMP-2+DXM組、對兩組有差異(P＜0.05);DXM組與BMP-2組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），與BMP-2+DXM組、對兩組有差異（P＜0.05）;BMP-2+DXM組、對照組與其他組間均存在差異（P＜0.

9、05）;提示經(jīng)BMP-2和DXM誘導(dǎo)后各組hDPCs的分化標(biāo)志基因強烈表達(dá)。經(jīng)誘導(dǎo)7d各處理組基因表達(dá)量趨于同化平穩(wěn)。DSPP基因表達(dá)量BMP-2組、DXM組、BMP-2+DXM組大于對照組(P＜0.05)，但BMP-2組、DXM組、BMP-2+DXM組的組間比較無明顯差異（P＞0.05）;同時，ALP、DMP-1基因表達(dá)量四個組間無明顯差異(P＞0.05)。培養(yǎng)14 d，經(jīng)堿性磷酸酶染色檢測，BMP-2組、DXM組、BMP-2+DXM

10、組、對照組可見不同著色程度的紫黑色沉淀，其中BMP-2+DXM組著色程度最深，表現(xiàn)為強陽性;經(jīng)半定量測定陽性染色率:BMP-2組、DXM組、BMP-2+DXM組、對照組依次為0.368±0.004,0.337±0.022,0.849±0.013,0.181±0.008,BMP-2+DXM組＞BMP-2組≈DXM組＞D組，BMP-2+DXM組、對照組與其他各組均有差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），BMP-2組、DXM組差異無統(tǒng)計學(xué)意

11、義（P＞0.05），與BMP-2+DXM組、對照組均有差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。培養(yǎng)21d，茜素紅染色示，BMP-2組、DXM組、BMP-2+DXM組均出現(xiàn)大小及著色程度不一的橘紅色礦化結(jié)節(jié)，其中BMP-2+DXM組礦化結(jié)節(jié)呈片狀大面積分布，BMP-2組、DXM組呈散在分布;對照組無礦化結(jié)節(jié)形成。BMP-2組、DXM組、BMP-2+DXM組、對照組A值比較為BMP-2+DXM組＞BMP-2組＞DXM組＞對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)