rAAV2-hBMP-7對人牙髓細胞分化的影響.pdf

1、BMP—7(bone morphogenetic protein—7，BMP—7)是1990年克隆得到的骨細胞因子，能誘導間充質細胞向軟骨細胞、成骨細胞分化，異位誘導軟骨和骨的形成。研究表明BMP—7能促進牙髓細胞分化，誘導修復性牙本質形成，是一種良好的、促進牙本質再生的生物蓋髓劑。但BMPs生物半衰期短、降解速度快、在缺損區(qū)難保持足夠時間的生物活性，限制其在臨床中的應用。因此如何能使BMPs持續(xù)、適量地釋放是目前亟待解決的關鍵問題。基

2、因治療為BMPs的應用提供新的思路。本課題組前期研究曾將腺病毒(adenovirus，Ad)作為BMP—7載體轉入人牙髓細胞(human dental pulp cells，hDPCs)，發(fā)現(xiàn)轉染后的hDPCs能成功表達BMP—7蛋白并能誘導hDPCs分化。然而Ad載體在表達目的蛋白的同時表達病毒衣殼蛋白，引發(fā)機體的炎癥和免疫應答，其安全性成為人們擔憂的隱患。腺相關病毒(adeno—associated virus，AAV)以其免疫原性

3、小、安全性好、無致病性等優(yōu)點成為基因治療的新型載體，逐漸受到學者的關注。AAV載體已廣泛用于各種組織的基因治療，如骨組織、心肌組織等。目前已發(fā)現(xiàn)的AAV至少有8種，其中最常用的類型有AAV2型與AAV2/1型。不同類型的AAV由于衣殼蛋白的不同對細胞具有不同的親和性。AAV2與AAV2/1中哪種類型更適合hDPCs的基因治療，目前無相關研究報道。本實驗分別將帶有綠色熒光蛋白基因的rAAV載體(recombinant adeno—asso

4、ciated virus—mediated enhanced green fluorescent protein，rAAV—EGFP) rAAV2-EGFP、rAAV2/1-EGFP轉染hDPCs，通過比較兩者在hDPCs中的轉染效率，選擇較合適載體；構建帶有目的基因hBMP—7的AAV載體，轉入hDPCs，Western blot檢測轉染后hDPCs hBMP—7的表達；觀察rAAV—hBMP—7轉染后hDPCs的堿性磷酸酶(alka

5、line phosphatase，ALP)活性以及牙本質涎磷蛋白(dentin sialoprotein，DSPP)、骨鈣素(osteocalcin，OCN) mRNA表達，探討rAAV—hBMP—7轉染對hDPCs分化的調節(jié)作用，為活髓保存的基因治療提供實驗基礎。 目的： 比較rAAV2-EGFP和rAAV2/1-EGFP對hDPCs的轉染效率及病毒轉染對hDPCs的毒性，篩選轉染hDPCs的較合適載體；構建rAAV—

6、hBMP—7并制備重組病毒液；檢測經(jīng)rAAV—hBMP—7轉染后hDPCs hBMP—7蛋白的表達，研究hBMP—7基因轉染對hDPCs分化的調節(jié)作用，為進一步開展活髓保存治療的體外及臨床研究提供實驗依據(jù)。 研究方法： ①采用酶消化組織塊法培養(yǎng)hDPCs并鑒定組織來源；②將rAAV2-EGFP、rAAV2/1-EGFP按感染復數(shù)(multiple of infection，MOI)104、105、5×105轉染第2代hD

7、PCs，轉染后48h免疫熒光顯微鏡觀察各組綠色熒光蛋白表達情況，確定rAAV轉染hDPCs的最適MOI值；流式細胞儀檢測轉染后7d rAAV2-EGFP和rAAV2/1-EGFP在hDPCs中的轉染效率；MTT法檢測rAAV2-EGFP、rAAV2/1-EGFP按最適MOI值轉染hDPCs后4d、6d、8d、10d、12d的增殖活性；③構建rAAV—hBMP—7載體；④Western blot檢測rAAV—hBMP—7轉染后7d、14d

8、和21d hDPCs中hBMP—7蛋白的表達；⑤堿性磷酸酶活性檢測與茜素紅礦化結節(jié)染色檢測rAAV—hBMP—7轉染后hDPCs體外礦化能力；Realtime—PCR檢測DSPP、OCN mRNA的表達，觀察rAAV—hBMP—7轉染后hDPCs分化的生物學特性。 結果： ①酶消化組織塊法可有效進行hDPCs的原代培養(yǎng)。免疫細胞化學顯示所獲得的細胞均為抗波形絲蛋白染色陽性，抗角蛋白染色陰性；②rAAV2-EGFP、rAA

9、V2/1-EGFP轉染hDPCs后48h熒光顯微鏡下觀察，EGFP的表達數(shù)隨著MOI值的增加而增高，當MOI值為104，105，5×105時rAAV2-EGFP轉染hDPCs48h的轉染率分別為(42.33±3.42)％、(67.58±0.99)％、(73.46±1.36)％；rAAV2/1-EGFP轉染轉染率分別為(13.63±0.91)％、(34.9±0.678)％、(43.8±1.48)％；rAAV2-EGFP的轉染效率在各MOI

10、值均較rAAV2/1-EGFP高；按MOI值為105轉染hDPCs后7d流式細胞儀檢測rAAV2-EGFP、rAAV2/1-EGFP轉染率分別為87.6％、35.8％；rAAV2-EGFP、rAAV2/1-EGFP轉染細胞后細胞生長正常，MTT結果顯示轉染后兩轉染組與未轉染組在各時間點吸光度值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；③成功構建rAAV2-hBMP—7，其滴度為5×1021v．g/ml；④Western blot結果顯示rAAV

11、2-hBMP—7轉染hDPCs后能成功表達hBMP—7，轉染后7d蛋白表達量最高，隨著時間的延長蛋白表達量逐漸降低，但在21d仍有hBMP—7蛋白表達；⑤ALP活性檢測結果顯示，rAAV2-hBMP—7轉染hDPCs后ALP活性逐漸增強，且呈時間依賴性。轉染后4d、7d、10d、14d rAAV2-hBMP—7組與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，rAAV2-EGFP組在各時間點與對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

12、茜素紅染色結果顯示轉染后的hDPCs連續(xù)培養(yǎng)14d有礦化結節(jié)形成，表明rAAV2-hBMP—7轉染后的hDPCs具有礦化能力；⑥Real—time PCR結果顯示，rAAV2-hBMP—7組在轉染后7d、14d DSPP、OCN mRNA表達量均較rAAV2-EGFP組上調，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。轉染后7d，DSPP、OCNmRNA表達量增加顯著(P<0.01)，隨著時間延長mRNA表達量逐漸降低，轉染后21d仍可以檢測到

13、DSPP、OCN mRNA表達，但與對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，因此rAAV2-hBMP—7轉染hDPCs后能夠誘導hDPCs分化。 結論： rAAV可以轉染hDPCs并獲得較高的轉染效率；rAAV2-EGFP對體外培養(yǎng)的hDPCs轉染效率高于rAAV2/1-EGFP，是轉染hDPCs較適合的載體；成功構建并獲得滴度為5×1011v．g/ml的rAAV2-hBMP—7。rAAV2-hBMP—7轉染hDP