重組pIRES2-EGFP-hBMP2載體的構(gòu)建及其對人牙齦成纖維細(xì)胞表型的影響.pdf

1、牙周治療的最終目標(biāo)是實現(xiàn)牙周組織完全功能性再生，其中包括牙齦、牙周膜、牙骨質(zhì)和牙槽骨協(xié)調(diào)一致地、生理性再生。傳統(tǒng)的牙周治療和引導(dǎo)性組織再生技術(shù)雖取得一定的臨床效果，但總的看來，尚不能達(dá)到牙周組織完全再生的目的。組織工程技術(shù)引入牙周病治療的研究領(lǐng)域，為這一目標(biāo)的實現(xiàn)帶來了新的希望。組織工程學(xué)研究的主要內(nèi)容包括種子細(xì)胞的來源、生物載體支架的選擇以及細(xì)胞／載體支架復(fù)合體的構(gòu)建等三個方面。種子細(xì)胞的研究是牙周組織工程的重要內(nèi)容。牙周膜（PDL）

2、細(xì)胞是一組具有多向分化潛能的異質(zhì)性細(xì)胞，其中的未分化間充質(zhì)細(xì)胞可分化為成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞，是牙周組織再生的主要細(xì)胞。作為種子細(xì)胞，PDL細(xì)胞具有一定的局限性，它來源有限，須拔除一定量自體牙后才能獲得，難以在臨床上廣泛開展。
　　牙齦成纖維細(xì)胞作為牙周組織的組成成分，來源豐富、容易獲得、具有很強(qiáng)的生長和自我繁殖能力，在適當(dāng)?shù)拇碳は?，可表達(dá)成骨細(xì)胞表型。人骨形成蛋白2(hBMP2)是BMP家族中誘骨活性最強(qiáng)的一種，也是

3、唯一能單獨誘導(dǎo)成骨的因子，在牙周組織再生和修復(fù)中具有重要的作用。
　　本研究利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將hBMP2基因轉(zhuǎn)染牙齦成纖維細(xì)胞，賦予其成骨細(xì)胞特性，探討將其作為理想的種子細(xì)胞應(yīng)用于牙周組織工程的可能性。為此，本研究進(jìn)行了如下幾方面的實驗：
　?、儆肦T-PCR方法從人成骨肉瘤細(xì)胞系OS-9901中成功克隆了hBMP2基因，測序鑒定完全正確后，通過基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了該基因的真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-hBMP2，

4、該實驗結(jié)果為后續(xù)研究hBMP2對牙齦成纖維細(xì)胞表型的影響奠定了基礎(chǔ)。
　?、诶弥|(zhì)體轉(zhuǎn)染法成功地將hBMP2基因轉(zhuǎn)入人牙齦成纖維細(xì)胞中，經(jīng)G418篩選后，獲得了穩(wěn)定表達(dá)hBMP2的細(xì)胞克隆；通過熒光顯微鏡、RT-PCR、蛋白印跡和ELISA等方法進(jìn)一步檢測了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中hBMP2的表達(dá)情況，實驗結(jié)果表明本實驗獲得了穩(wěn)定表達(dá)hBMP2的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，此細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)分泌型hBMP2達(dá)至少9代以上。
　?、墼谏鲜鰧嶒灥幕A(chǔ)上，對

5、穩(wěn)定表達(dá)hBMP2的人牙齦成纖維細(xì)胞從形態(tài)、增殖特性和細(xì)胞周期、堿性磷酸酶活性和骨鈣素合成以及體外形成礦化結(jié)節(jié)的能力等方面，對其生物學(xué)特性進(jìn)行了觀察。結(jié)果顯示，部分轉(zhuǎn)染細(xì)胞由梭形轉(zhuǎn)化為多角形；細(xì)胞倍增時間和細(xì)胞增殖周期無明顯改變；與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染細(xì)胞堿性磷酸酶活性和骨鈣素合成水平明顯升高（P<0.01）；并在礦化液作用下形成礦化結(jié)節(jié)。結(jié)果提示：hBMP2基因轉(zhuǎn)染后人牙齦成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性發(fā)生明顯改變，表達(dá)成骨細(xì)胞表型，具有了某些