轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子FHL2對(duì)人牙髓細(xì)胞分化及礦化的調(diào)控作用研究.pdf

1、目的:
　　 牙齒硬組織發(fā)育過(guò)程包括基質(zhì)的形成和礦化的發(fā)生，是在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化形成后，接著開始形成牙本質(zhì)的有機(jī)基質(zhì)，由成牙本質(zhì)細(xì)胞形成的Ⅰ型膠原分泌到基質(zhì)中去，與基質(zhì)共同形成最早的牙本質(zhì)基質(zhì)。除了Ⅰ型膠原外，成牙本質(zhì)細(xì)胞還分泌非膠原蛋白，包括:牙本質(zhì)磷蛋白(detin phosphoproteins，DPP)、牙本質(zhì)涎蛋白(detin sialoprotein，DSP)、牙本質(zhì)涎磷蛋白(detinsialophosphopro

2、tein，DSPP)、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(DMP1)、骨涎蛋白(bonesialoprotein，BSP)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)和其他一些生長(zhǎng)因子及金屬蛋白酶等。其中DPP、DSP和DSPP屬于牙本質(zhì)特異性蛋白，而DMP1、BSP、OPN、OCN為礦化組織特異性蛋白，它們?cè)谡T導(dǎo)細(xì)胞分化及促進(jìn)牙本質(zhì)礦化起重要的作用。在牙本質(zhì)基質(zhì)形成和礦化的過(guò)程中，有很多的生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)

3、錄因子等參與進(jìn)來(lái)，但它們確切的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。
　　 FHL2(Four and a half LIM domains2)蛋白分子結(jié)構(gòu)中含有4個(gè)半LIM結(jié)構(gòu)域，共含有279個(gè)氨基酸。其中，LIM結(jié)構(gòu)域是以結(jié)構(gòu)中的前三個(gè)蛋白Lin-11、Isl-1和Mec-3的首字母命名的，LIM結(jié)構(gòu)域是含有55個(gè)氨基酸殘基的序列，富含半胱氨基酸并含鋅指結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域。LIM結(jié)構(gòu)域作為蛋白與蛋白之間相互作用的結(jié)構(gòu)域，在細(xì)胞分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞骨架

4、的形成中發(fā)揮著不可替代的作用。而FHL2蛋白作為完全由LIM結(jié)構(gòu)域組成的蛋白同樣發(fā)揮著LIM結(jié)構(gòu)域的功能，并且由于FHL2結(jié)構(gòu)的差異性又有著與LIM結(jié)構(gòu)域不同的作用。研究表明，F(xiàn)HL2通過(guò)LIM結(jié)構(gòu)域與某些受體、激酶、轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)分子等蛋白相互作用，在基因表達(dá)，蛋白分泌，細(xì)胞分化，形態(tài)發(fā)生、組織形成等過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)FHL2蛋白作為重要的轉(zhuǎn)錄共激活子，在成骨細(xì)胞的分化、礦化和骨組織的形成中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

5、進(jìn)一步的研究表明FHL2通過(guò)轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)整合素蛋白家族、Wnt、RUNX2等信號(hào)通路參與骨組織的形成。牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化及礦化過(guò)程中有類似骨組織的硬組織形成，我們推測(cè)FHL2可能也參與牙齒硬組織的形成過(guò)程。我們課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FHL2在牙齒發(fā)育過(guò)程中呈時(shí)空特異性表達(dá)，F(xiàn)HL2可能對(duì)牙胚發(fā)育、細(xì)胞分化（包括成釉細(xì)胞及成牙本質(zhì)細(xì)胞）、形態(tài)發(fā)生及硬組織基質(zhì)的分泌與礦化有重要的調(diào)節(jié)作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，為進(jìn)一

6、步檢測(cè)FHL2對(duì)牙本質(zhì)形成的調(diào)控作用，我們體外培養(yǎng)了人牙髓細(xì)胞，并制備FHL2真核表達(dá)載體質(zhì)粒，將所制備的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人牙髓細(xì)胞，使之穩(wěn)定過(guò)表達(dá)FHL2蛋白，觀察FHL2對(duì)人牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化及礦化的影響，從而進(jìn)一步闡明FHL2對(duì)牙本質(zhì)形成的調(diào)控作用機(jī)制。
　　 材料和方法:
　　 1.組織塊培養(yǎng)法和膠原酶消化法培養(yǎng)分離人牙髓細(xì)胞，比較兩方法的差異性，加入礦化誘導(dǎo)液使牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化并礦化，檢

7、測(cè)在這一過(guò)程中FHL2 mRNA和蛋白表達(dá)量的變化。
　　 2.大腸桿菌提取重組質(zhì)粒pcDNA3-FHL2-Flag和空載體質(zhì)粒pcDNA3，雙酶切實(shí)驗(yàn)和質(zhì)粒測(cè)序檢驗(yàn)重組質(zhì)粒中插入的FHL2基因讀碼框架。
　　 3.將FHL2重組質(zhì)粒pcDNA3-FHL2-Flag和空載體質(zhì)粒pcDNA3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入人牙髓細(xì)胞，72h后檢測(cè)帶有外源基因的重組質(zhì)粒能否在人牙髓細(xì)胞中表達(dá)。
　　 4.將pcDNA3-FHL2-Flag

8、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入人牙髓細(xì)胞，檢測(cè)牙髓細(xì)胞向人成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化和礦化過(guò)程中，ALP、BSP、OPN及DSPP等蛋白的表達(dá)差異及礦化結(jié)節(jié)的形成情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.利用組織塊法和酶消化組織塊法均可分離培養(yǎng)出牙髓細(xì)胞，成功獲得了人牙髓細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究模型。
　　 2.加入礦化誘導(dǎo)液后，誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞礦化，Real time PCR和Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著礦化誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)HL2蛋白表達(dá)量逐漸增

9、加，誘導(dǎo)7d到14d時(shí)FHL2表達(dá)量增加最顯著。
　　 3.重組質(zhì)粒pcDNA3-FHL2-Flag經(jīng)酶切鑒定和重組質(zhì)粒測(cè)序，結(jié)果顯示加入了編碼正確的FHL2基因，成功制備了基因全長(zhǎng)FHL2的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染人牙髓細(xì)胞后經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)株。RT-PCR結(jié)果顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中具有大量目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄，Western blot檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性，同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)FHL2的細(xì)胞可以檢測(cè)到標(biāo)簽蛋白Flag。

10、　　 4.檢測(cè)各組牙髓細(xì)胞在向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化及礦化過(guò)程中，穩(wěn)定過(guò)表達(dá)FHL2的牙髓細(xì)胞中ALP的活性顯著增高;礦化結(jié)節(jié)形成的數(shù)量較轉(zhuǎn)染空載體組和未轉(zhuǎn)染組明顯增加;成骨相關(guān)因子mRNA和蛋白表達(dá)量均有所上調(diào)。
　　 結(jié)論:
　　 1.利用組織塊法和酶消化組織塊法均可分離培養(yǎng)出牙髓細(xì)胞，酶消化組織塊法可較早見到細(xì)胞爬出，并且細(xì)胞生長(zhǎng)較快且狀態(tài)較好，組織塊法培養(yǎng)牙髓細(xì)胞時(shí)間較長(zhǎng)，且失敗率較酶消化法高。
　　

11、2.在人牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的分化及礦化過(guò)程中(0d，7d，14d，21d)，F(xiàn)HL2的表達(dá)量逐漸增加，提示FHL2可能參與了牙本質(zhì)的形成過(guò)程。
　　 3.重組質(zhì)粒pcDNA3-FHL2-Flag經(jīng)鑒定加入了正確的FHL2編碼框，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染牙髓細(xì)胞后，牙髓細(xì)胞可表達(dá)FHL2蛋白和標(biāo)簽蛋白Flag，經(jīng)G418篩選獲得了可以穩(wěn)定表達(dá)FHL2的人牙髓細(xì)胞。說(shuō)明重組質(zhì)粒pcDNA3-FHL2-Flag可以作為外源性的FHL2基因轉(zhuǎn)