脫礦牙本質(zhì)提取液對(duì)人牙髓細(xì)胞分化的影響.pdf

1、研究背景:活髓保存術(shù)是臨床治療牙髓疾病常用的技術(shù)手段。氫氧化鈣作為蓋髓劑的金標(biāo)準(zhǔn)廣泛應(yīng)用于臨床。但是長期的隨訪記錄顯示遠(yuǎn)期效果并不理想。微滲漏，牙髓鈣化，牙內(nèi)吸收是造成治療失敗的常見原因。如何獲得具有生物活性和誘導(dǎo)再生能力的蓋髓材料是口腔工作者的目標(biāo)。細(xì)胞外基質(zhì)分子被證明能夠分泌多種細(xì)胞生長所需的蛋白和活性因子，牙髓組織中被證明含有不同層次的未分化細(xì)胞群。利用牙本質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)分子誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，可能是解決這一問題的思路。

2、
　　目的:
　　1.體外培養(yǎng)牙髓細(xì)胞，為研究進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和利用牙髓細(xì)胞提供基礎(chǔ)。
　　2.探索處理人牙本質(zhì)基質(zhì)的脫礦方法，觀察以浸提方式獲得脫礦牙本質(zhì)中的細(xì)胞外基質(zhì)分子對(duì)牙髓細(xì)胞體外分化的影響，為組織工程化牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的研究提供新的線索。
　　材料和方法:
　　1.征得患者及家屬同意后，按一定納入標(biāo)準(zhǔn)收集臨床因阻生或正畸治療拔除的青少年恒牙。采用改良組織塊法體外培養(yǎng)牙髓細(xì)胞(hDPCs)，倒置相差顯微鏡

3、下觀察細(xì)胞形態(tài)。收集第二代hDPCs，利用免疫熒光法鑒定細(xì)胞組織來源。收集生長穩(wěn)定的第三代hDPCs繪制細(xì)胞生長曲線圖。
　　2.臨床收集因正畸治療拔除的健康完整第一前磨牙，利用高速渦輪手機(jī)，金剛砂車針和機(jī)用根管銼制備單一牙本質(zhì)小體。通過超聲清洗，梯度脫礦，滅菌等系列操作處理牙本質(zhì)。將處理過的牙本質(zhì)轉(zhuǎn)入含雙抗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中孵育24小時(shí)，收集培養(yǎng)液即為脫礦牙本質(zhì)(TDM)提取液，保存于4℃冰箱中備用。酶聯(lián)免疫吸附劑測定TDM提取液中

4、成牙相關(guān)蛋白COL-1、TGF-β1、DSPP及DMP-1的釋放情況。
　　3.設(shè)置實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組用TDM浸提液誘導(dǎo)培養(yǎng)hDPCs，對(duì)照組用普通DMEM培養(yǎng)基替代。CCK-8法比較兩組細(xì)胞的增殖活性。采用real time PCR檢測實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組hDPCs成牙相關(guān)蛋白OPN、OCN、BSP、DMP-1及DSP的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.共收集牙髓組織標(biāo)本30個(gè)，長出原代6瓶，成功率為20％，傳至第3代以

5、上因污染斷代3瓶。體外培養(yǎng)牙髓細(xì)胞3～4天可以觀察到有細(xì)胞從組織塊游出，10天左右可以爬滿蓋玻片。細(xì)胞大部分為長梭形成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，少部分呈多角形、星形。成渦輪狀或束狀排列。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示hDPCs陽性表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志Vimentin，陰性表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志CK-14。細(xì)胞生長曲線約呈“S”形，從第3天進(jìn)入指數(shù)生長。
　　2.脫礦處理后的牙本質(zhì)約為5mm（長）×2mm（寬）×1mm（厚）大小的柱狀小體，表面形態(tài)光滑。利用酶

6、聯(lián)免疫吸附劑測定脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)和普通牙本質(zhì)基質(zhì)釋放COL-1，TGF-β1，DSPP及DMP-1能力，兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.利用TDM提取液誘導(dǎo)hDPCs，CCK-8檢測結(jié)果顯示誘導(dǎo)組hDPCs活性高于對(duì)照組。Real time PCR檢測結(jié)果顯示誘導(dǎo)組hDPCs成牙相關(guān)蛋白OPN、OCN、BSP、DSPP及DMP-1表達(dá)顯著高于對(duì)照組。
　　結(jié)論:
　　1.改良組織塊法培養(yǎng)人牙髓原代細(xì)胞簡單易操作，并且成功率較