Nell-1蛋白對(duì)我牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化的作用研究.pdf

1、目的：
　　Nell-1(Nel-like molecule-1)是近年發(fā)現(xiàn)的一種分泌型蛋白，它在成骨細(xì)胞的分化、骨形成和骨再生等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Nell-1在小鼠磨牙牙胚發(fā)育過程中呈時(shí)空特異性表達(dá)，在牙胚發(fā)育的成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中呈強(qiáng)陽性表達(dá)。初步推測(cè)Nell-1可能在牙胚發(fā)育、成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中發(fā)揮作用。目前為止，Nell-1在成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化及牙本質(zhì)形成過程中發(fā)揮的作用尚不明確，本實(shí)驗(yàn)擬

2、通過體外試驗(yàn)研究人重組Nell-1對(duì)人牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化的影響，以揭示Nell-1在牙髓細(xì)胞成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化過程中發(fā)揮的作用。
　　材料和方法：
　　1、應(yīng)用改良酶消化法培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞。
　　2、使用不同濃度的Nell-1蛋白(0、50 ng/ml、100 ng/ml、150ng/ml)作用于礦化誘導(dǎo)階段的人牙髓細(xì)胞，礦化第3d收集細(xì)胞蛋白并測(cè)定不同濃度Nell-1蛋白處理后人牙髓細(xì)胞的堿性磷酸酶(

3、alkaline phosphatase，ALP)活性。然后選取最佳顯效濃度的Nell-1蛋白處理牙髓細(xì)胞，培養(yǎng)3d、5d、7d，檢測(cè)Nell-1蛋白處理后的人牙髓細(xì)胞在不同礦化時(shí)間點(diǎn)的ALP活性。
　　3、使用最佳顯效濃度的Nell-1蛋白作用于人牙髓細(xì)胞，礦化0、6h、12h、24h，提取人牙髓細(xì)胞的總RNA和總蛋白。應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)與成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的相關(guān)基因骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、牙本

4、質(zhì)基質(zhì)蛋白-1(dentine matrix protein-1， DMP-1)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)和核心結(jié)合蛋白因子1(runt-related transcription factor1，Runx2)在不同礦化誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)的mRNA水平表達(dá)差異性，應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)OPN和DMP-1在蛋白水平的表達(dá)差異性。
　　結(jié)果：
　　1、用改良酶消化法成功培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞，將狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞

5、用于后續(xù)試驗(yàn)。
　　2、使用濃度為0（空白對(duì)照）、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml的Nell-1蛋白礦化誘導(dǎo)人牙髓細(xì)胞3d，發(fā)現(xiàn)50ng/ml Nell-1蛋白處理組與空白對(duì)照組的ALP活性沒有明顯差異;100ng/ml、150ng/ml Nell-1蛋白處理組與空白對(duì)照組相比，ALP活性明顯升高(p＜0.05)，且100ng/ml、150ng/ml Nell-1蛋白處理組的ALP活性呈現(xiàn)濃度依賴性增高。選取Ne

6、ll-1蛋白的最佳起效濃度100ng/ml，分別礦化誘導(dǎo)人牙髓細(xì)胞3d、5d、7d，發(fā)現(xiàn)隨著礦化時(shí)間的延長(zhǎng)，ALP活性逐漸增高;且相同礦化時(shí)間點(diǎn)上Nell-1蛋白處理組與空白對(duì)照組相比，ALP活性顯著增高(p＜0.05)。
　　3、用100ng/ml的Nell-1蛋白處理人牙髓細(xì)胞，Real-time PCR結(jié)果顯示在同一誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)上，OPN、DMP-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量均比空白對(duì)照組增高，礦化誘導(dǎo)12h、24h時(shí)，OPN、DM

7、P-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著增高，而OCN、Runx2在各時(shí)間點(diǎn)的mRNA相對(duì)表達(dá)量無明顯差異(p＞0.05)。在蛋白表達(dá)水平上，刺激后6h時(shí)，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的OPN和DMP-1表達(dá)量無明顯差異;在12h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組OPN和DMP-1明顯高于對(duì)照組;在刺激24h時(shí)，兩組蛋白表達(dá)量差異更加明顯(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、經(jīng)改良酶消化法體外培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)較一致，原代細(xì)胞形態(tài)較復(fù)雜，傳代至第三代，細(xì)