大鼠脂肪干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的研究.pdf

1、第一部分，大鼠脂肪干細(xì)胞的獲取、增殖、傳代以及多向分化能力的檢測
　　目的：探索并固定大鼠脂肪干細(xì)胞獲得、增殖和傳代的方法和操作流程,并且通過誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞分化為成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞而證明脂肪干細(xì)胞的多向分化能力。
　　方法：取質(zhì)量約120克的SD大鼠2只,性別不限,分離其腹股溝脂肪組織,將其剪碎并用濾網(wǎng)過濾,然后經(jīng)一系列操作而將含有脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)液平鋪于25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),并進(jìn)而增殖、傳代。之后,通過細(xì)胞流式分析檢測第

2、三代細(xì)胞表型證明其為脂肪干細(xì)胞。之后分別更換成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基和成骨細(xì)胞培養(yǎng)基,誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞定向分化為脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞。
　　結(jié)果：成功分離培養(yǎng)出脂肪干細(xì)胞,并能進(jìn)行增殖和傳代。利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測脂肪干細(xì)胞的CD34(+)、CD44(+)、CD45(-)、CD106(+),證明該細(xì)胞為脂肪干細(xì)胞。而向脂肪和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞均發(fā)生了明顯變化,最后分別通過油紅O染色和堿性磷酸酶試劑盒證明脂肪干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。
　

3、　結(jié)論：脂肪組織中存在脂肪干細(xì)胞,并能夠成功的分離、增殖和傳代。并且擁有多向分化能力?？梢猿晒Φ恼T導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。
　　第二部分，大鼠脂肪干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)樣細(xì)胞
　　目的：使用神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)液將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞。
　　方法：首先是將第三代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中貼壁達(dá)到80％以上時(shí)消化,然后使其重新貼壁于六孔板中,細(xì)胞數(shù)量約為105級(jí)。然后用添加了bFGF和EGF以及B27的Ne

4、urobasal培養(yǎng)基培養(yǎng)六孔板中的細(xì)胞。每3天半量添加新的培養(yǎng)液,至5-7天左右就可以看到細(xì)胞增殖形成培養(yǎng)液中懸浮的細(xì)胞球。取誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天的細(xì)胞球進(jìn)行nestin的免疫熒光染色。最后,將培養(yǎng)好的細(xì)胞球吹散,離心,并將之培養(yǎng)在僅添加了B27的Neurobasal培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化10天,然后再進(jìn)行NeuN、GFAP和β-tubulin熒光染色來鑒定分化成的細(xì)胞。
　　結(jié)果：在使用了含有bFGF和EGF以及B27的Neurobasa

5、l培養(yǎng)基誘導(dǎo)了5天時(shí)就出現(xiàn)了懸浮的細(xì)胞球,并且通過免疫熒光染色證明為nestin陽性,證明其為神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞球。而在使用了僅添加了B27的Neurobasal培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化10天后,打散的細(xì)胞球細(xì)胞也分化成了神經(jīng)細(xì)胞,并經(jīng)過了MAP2ab、NeuN、GFAP和β-tubulin熒光染色鑒定,證明分化成了神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　結(jié)論：經(jīng)特定的誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)后,脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可以被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞并且進(jìn)一步分化為神經(jīng)元和