Runx2調(diào)控小鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞與成釉細(xì)胞的分化以及牙齒礦化的研究.pdf

1、Runx2是一種在成骨細(xì)胞分化及牙齒的發(fā)育過(guò)程中起著重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，牙齒以及骨組織中的特異性基質(zhì)蛋白在轉(zhuǎn)錄水平均受其調(diào)控。Runx2缺陷導(dǎo)致包括牙齒在內(nèi)的全身硬組織疾病，如鎖骨顱骨發(fā)育異常（CCD）。Runx2基因敲除表現(xiàn)出嚴(yán)重的骨及牙齒發(fā)育障礙。結(jié)合Runx2的轉(zhuǎn)錄因子特性，以及在牙齒發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)特征，可以推測(cè)Runx2可能也是牙齒發(fā)育和礦化的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。最近有研究發(fā)現(xiàn)，在牙胚發(fā)育過(guò)程中Runx2存在著表達(dá)的時(shí)空性，并且

2、證實(shí)Runx2可以調(diào)控牙齒發(fā)育中的某些特異性基質(zhì)蛋白的表達(dá)。同時(shí)，有結(jié)果顯示，釉原蛋白基因的啟動(dòng)子（-1641、+92）和牙本質(zhì)涎磷蛋白基因的啟動(dòng)子（-3950、-3106）上存在Runx2結(jié)合位點(diǎn)，Runx2可以通過(guò)該位點(diǎn)顯著上調(diào)這兩種基因的表達(dá)。目前，在細(xì)胞水平上已經(jīng)證實(shí)，Runx2調(diào)控著多種與礦化相關(guān)蛋白的表達(dá)，但在動(dòng)物水平上，Runx2又是如何調(diào)控蛋白表達(dá)以及對(duì)礦化又有哪些影響呢？
　　因此，本課題通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段分別建立在

3、成釉細(xì)胞與成牙本質(zhì)細(xì)胞中特異性過(guò)表達(dá)Runx2的小鼠模型，研究Runx2對(duì)分化晚期的成釉細(xì)胞與成本質(zhì)細(xì)胞分化的影響以及因此造成的牙釉質(zhì)與牙本質(zhì)礦化的表型改變。為此，我們的課題共分為兩部分：
　　第一部分構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠
　　我們分別構(gòu)建pBluescriptIIKS(+)-AmelogeninPromoter-Runx2和pBluescriptIIKS(+)-DSPPPromoter-Runx2質(zhì)粒載體。通過(guò)顯微注射，將線性化

4、的質(zhì)粒注入小鼠受精卵中，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠，并且設(shè)計(jì)特異性引物，利用PCR技術(shù)，鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠的基因整合和表達(dá)情況。通過(guò)qRT-PCR篩選表達(dá)高的鼠系進(jìn)行表型的分析。
　　第二部分轉(zhuǎn)基因小鼠表型分析
　　實(shí)驗(yàn)一DSPPPromoter-Runx2轉(zhuǎn)基因小鼠表型分析
　　在牙本質(zhì)形成的啟始階段，轉(zhuǎn)基因小鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞完全喪失本身的高柱狀形態(tài)和極化方向，前期牙本質(zhì)和牙本質(zhì)小管結(jié)構(gòu)消失，牙本質(zhì)變薄呈均質(zhì)狀的骨基質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，并且髓腔

5、中出現(xiàn)新生的骨樣結(jié)構(gòu)，表明Runx2抑制了成牙本質(zhì)細(xì)胞的最終分化成熟，并誘導(dǎo)處于分化晚期狀態(tài)的成牙本質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。同時(shí)，強(qiáng)烈抑制DSPP的表達(dá)和牙本質(zhì)的形成，形成類骨基質(zhì)樣組織替代正常的牙本質(zhì)。
　　實(shí)驗(yàn)二AmelogeninPromoter-Runx2轉(zhuǎn)基因小鼠表型分析
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠成釉細(xì)胞失去原有的高柱狀形態(tài)和極化特征，釉基質(zhì)的形成受到抑制，釉基質(zhì)在成釉細(xì)胞分泌早期階段就已被阻斷，并且釉原蛋白表達(dá)下調(diào)