FHL2通過與TGF-α-EGFR通路互作調(diào)控KGN細(xì)胞增殖.pdf

1、FHL2(Four and a half LIM domains protein2)基因是FHL基因家族中研究最多的一位成員，F(xiàn)HL2不僅可以結(jié)合不同轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，而且對(duì)于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也有重要調(diào)控作用。研究表明FHL2在人卵巢顆粒細(xì)胞瘤細(xì)胞中表達(dá)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α（Transforming growth factor-α，TGF-α）可通過PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路調(diào)控人卵巢顆粒細(xì)胞瘤細(xì)胞KGN增殖。但FHL2對(duì)

2、KGN細(xì)胞的調(diào)控作用、TGF-α與FHL2互作、以及該互作對(duì)顆粒細(xì)胞的調(diào)控作用尚不清楚。本課題以KGN為模型，對(duì)上述問題予以探究。本研究結(jié)果將為深入了解卵泡發(fā)育和卵泡發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供新的理論基礎(chǔ)，同時(shí)為卵泡發(fā)育相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提供新的研究思路。主要研究結(jié)果如下:
　　1.FHL2調(diào)控KGN細(xì)胞的增殖、周期及TGF-α的表達(dá)
　　干擾KGN細(xì)胞中FHL2的表達(dá)后，分別利用CCK-8試劑盒、流式細(xì)胞術(shù)以及RT-PCR檢測(cè)FHL

3、2對(duì)細(xì)胞增殖、周期的影響以及對(duì)TGF-α的表達(dá)調(diào)控:
　　1) CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，F(xiàn)HL2干擾組細(xì)胞存活率(1.00±0.01 vs0.32±0.05，p＜0.001)顯著降低;細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量比值發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL2干擾組細(xì)胞數(shù)比值顯著低于對(duì)照組(1.00±0.01 vs0.44±0.10，p＜0.05)，表明FHL2knockdown能夠抑制細(xì)胞增殖;
　　2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示，干擾FHL2

4、表達(dá)后，S期細(xì)胞比例顯著降低(13.17±0.13 vs8.90±0.04，p＜0.001)，提示FHL2可阻滯細(xì)胞周期;
　　3) RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，干擾FHL2后，TGF-α(1.03±0.10 vs0.19±0.01，p＜0.001)及其受體EGFR(1.08±0.12 vs0.70±0.30，p＜0.05)表達(dá)量均降低。
　　2.TGF-α促進(jìn)KGN細(xì)胞增殖
　　用TGF-α處理KGN細(xì)胞后，通過細(xì)胞計(jì)

5、數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，TGF-α處理組細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組(92.67±11.55 vs149.00±8.89，p＜0.001)，表明TGF-α促進(jìn)KGN細(xì)胞增殖。
　　3.TGF-α調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞中FHL2、EGFR、TGF-α的表達(dá)
　　用TGF-α處理KGN細(xì)胞后，通過RT-PCR的方法檢測(cè)FHL2、EGFR和TGF-α基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，TGF-α能夠上調(diào)FHL2（1.00±0.08 vs2.16

6、±0.29，p＜0.001)、EGFR（1.02±0.22 vs2.01±0.13，p＜0.001）及TGF-α基因的表達(dá)（1.03±0.10vs2.08±0.03，p＜0.01）;當(dāng)干擾FHL2后再添加TGF-α處理細(xì)胞，結(jié)果顯示FHL2(2.16±0.29 vs0.26±0.01,p＜0.001)、EGFR(2.01±0.13 vs0.78±0.05,p＜0.001)和TGF-α（2.08±0.03 vs1.16±0.19，p＜0.

7、001）的表達(dá)水平均下調(diào)。這說明TGF-α能夠上調(diào)FHL2、EGFR和TGF-α基因的表達(dá)，而抑制FHL2的表達(dá)后該上調(diào)作用不明顯。
　　4.TGF-α可通過MAPK通路調(diào)控FHL2表達(dá)
　　分別用信號(hào)通路抑制劑U0126、LY294002、AG1478處理KGN細(xì)胞3h后，再添加TGF-α培養(yǎng)KGN細(xì)胞，通過RT-PCR檢測(cè)FHL2、EGFR和TGF-α的表達(dá)水平。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn):
　　1) MEK蛋白抑制劑處

8、理后再添加TGF-α，與對(duì)照組相比，F(xiàn)HL2(2.16±0.29 vs0.79±0.07，p＜0.001)、EGFR（1.84±0.20 vs0.68±0.04，p＜0.001）以及TGF-α(1.46±0.32 vs0.52±0.25，p＜0.01)的表達(dá)水平均下調(diào);
　　2) PI3K蛋白抑制劑處理后再添加TGF-α，與對(duì)照組相比，F(xiàn)HL2（2.16±0.29 vs1.79±0.11，p＞0.05）的表達(dá)無(wú)顯著差異，而EGFR

9、（1.84±0.20 vs0.90±0.27，p＜0.01）和TGF-α（1.46±0.32 vs0.28±0.01，p＜0.01）的表達(dá)水平降低;
　　3) EGFR抑制劑處理細(xì)胞后再添加TGF-α，與對(duì)照組相比，F(xiàn)HL2（2.16±0.29 vs1.26±0.02，p＜0.05）、EGFR(1.84±0.20 vs1.32±0.11，p＜0.01)以及TGF-α(1.46±0.32vs0.28±0.24，p＜0.01)的表達(dá)水

10、平均顯著降低。
　　該結(jié)果表明，TGF-α與其受體EGFR結(jié)合后，通過MAPK信號(hào)通路參與對(duì)FHL2的表達(dá)調(diào)控。
　　5.TGF-α/EGFR/FHL2形成自分泌通路調(diào)控KGN細(xì)胞的增殖
　　本研究以人卵巢顆粒細(xì)胞瘤細(xì)胞系KGN為模型，研究了顆粒細(xì)胞中TGF-α與FHL2互作及其對(duì)KGN細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控作用和機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn):FHL2可能通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控TGF-α及其受體EGFR表達(dá)，而TGF-α對(duì)KGN細(xì)胞的增殖具