Nrip2通過非經(jīng)典Wnt通路調(diào)控大腸癌干細(xì)胞的自我更新.pdf

1、目的:大腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，占腫瘤相關(guān)死因的第二位。近年來盡管在提高患者生存率的化學(xué)療法上有了很大的進(jìn)展，但是大腸癌晚期患者的預(yù)后仍很差，總的死亡率在40％左右。闡明大腸癌分子機(jī)制是治療大腸癌的基礎(chǔ)和前提。研究提示大腸癌干細(xì)胞參與了大腸癌的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移和藥物抵抗。Wnt通路在大腸癌干細(xì)胞的自我更新中起了重要作用，然而Wnt通路作用于大腸癌干細(xì)胞的具體機(jī)制仍不明。本研究通過篩選和鑒定大腸癌干細(xì)胞中Wnt通路激活相關(guān)的蛋白，發(fā)現(xiàn)

2、核受體相互作用蛋白2(Nuclear receptor-interacting protein2，Nrip2)在大腸癌干細(xì)胞中表達(dá)增加，并檢測Nrip2在大腸癌干細(xì)胞自我更新中的作用，鑒定其關(guān)鍵作用靶蛋白，尋找Nrip2作用于大腸癌干細(xì)胞的潛在靶點(diǎn)，從而明確Nrip2對大腸癌生物學(xué)行為的影響。
　　方法:通過構(gòu)建SW620克隆球cDNA逆轉(zhuǎn)錄病毒文庫，篩選出Wnt通路激活相關(guān)的蛋白Nrip2表達(dá)增加。為探討Nrip2在大腸癌中的表

3、達(dá)情況，采用免疫組化和mRNA熒光原位雜交驗(yàn)證大腸癌病理組織切片中Nrip2蛋白的表達(dá)，并采用Real-time qPCR檢測大腸癌細(xì)胞和臨床樣本富集的克隆球中Nrip2的表達(dá)情況。為評價Nrip2在大腸癌干細(xì)胞自我更新中的作用，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Nrip2的大腸癌細(xì)胞系，觀察過表達(dá)Nrip2對大腸癌細(xì)胞克隆球成球能力、iPS和EMT相關(guān)因子的表達(dá)和體內(nèi)致瘤能力的影響。為研究Nrip2對大腸癌干細(xì)胞自我更新的作用機(jī)制，質(zhì)譜篩選Nrip2的靶蛋

4、白Frizzled1(Fzd1)，構(gòu)建各種結(jié)構(gòu)域突變體分析 Nrip2與Fzd1蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，以及Nrip2和下游靶分子的結(jié)合情況。通過免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)和Western blot篩選和鑒定了Nrip2非經(jīng)典Wnt通路的靶蛋白維甲酸相關(guān)孤兒受體β(Retinoic acid-related orphan receptor beta，Rorβ)，觀察了過表達(dá)Rorβ對大腸癌細(xì)胞克隆球形成能力、EM

5、T相關(guān)因子的表達(dá)和體內(nèi)致瘤能力的影響。通過基因芯片篩選出Rorβ的下游靶基因HMG盒轉(zhuǎn)錄因子1(High Mobility Group-box transcription factor1，HBP1)。并通過PepstatinA處理過表達(dá)Nrip2的大腸癌細(xì)胞觀察Nrip2的酶活性對其調(diào)控大腸癌干細(xì)胞自我更新的影響。
　　結(jié)果:構(gòu)建SW620克隆球cDNA逆轉(zhuǎn)錄病毒文庫，篩選出Wnt通路激活相關(guān)蛋白Nrip2表達(dá)增加。Nrip2表達(dá)

6、于正常大腸組織和大腸癌組織細(xì)胞中，在大腸癌干細(xì)胞中表達(dá)明顯升高。過表達(dá)Nrip2促進(jìn)了大腸癌干細(xì)胞的自我更新。我們發(fā)現(xiàn)Nrip2能夠與Fzd1結(jié)合，但不與β-catenin結(jié)合。免疫共沉淀篩選出Nrip2與Rorβ結(jié)合，其酶活性能夠降解Rorβ，阻止Rorβ入核。Rorβ通過抑制Wnt通路活性抑制大腸癌干細(xì)胞的自我更新?；蛐酒Y選發(fā)現(xiàn)Rorβ的下游靶基因是HBP1，HBP1通過競爭性結(jié)合TCF/LEF4抑制Wnt通路下游靶分子的轉(zhuǎn)錄。

7、Nrip2的酶活性的滅活阻斷了Nrip2對大腸癌干細(xì)胞的自我更新作用。
　　結(jié)論:首次發(fā)現(xiàn)了Nrip2和Rorβ表達(dá)于正常大腸組織和大腸癌組織細(xì)胞中。Nrip2在大腸癌干細(xì)胞中表達(dá)增加，與Rorβ結(jié)合呈酶活性依賴型，通過降解Rorβ，抑制HBP1的轉(zhuǎn)錄，啟動Wnt通路下游靶蛋白的表達(dá)，促進(jìn)了大腸癌干細(xì)胞的自我更新，從而介導(dǎo)了一條新的非經(jīng)典Wnt通路-Nrip2/Rorβ/HBP1通路。Nrip2的酶活性是干預(yù)阻斷大腸癌干細(xì)胞自我更