Hippo及Wnt信號(hào)通路在大腸癌發(fā)生中的作用及沉默YAP,Survivin基因?qū)Υ竽c癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、大腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，每年以2％的速度遞增。2012年統(tǒng)計(jì)全球大腸癌患者約140萬(wàn)人，其中6.939萬(wàn)人死亡該疾病，5年存活率從臨床Ⅰ期患者的90%至臨床Ⅳ期患者的10%不等。大腸癌早期癥狀不明顯，多數(shù)大腸癌診斷時(shí)已屬于晚期，甚至出現(xiàn)肝臟或其它器官的轉(zhuǎn)移。大腸癌最基本的治療方法是手術(shù)治療，術(shù)后輔助化療及放療。隨著診斷技術(shù)的發(fā)展和治療方法的改進(jìn)，大腸癌的預(yù)后得到逐步改善，但死亡率依然較高，主要原因是腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及耐藥的產(chǎn)生。

2、此外，化療和放療缺乏特異性和敏感性，副作用較大。因此迫切需要研究闡明大腸癌發(fā)生的分子機(jī)制，尋找更好的診斷及預(yù)后指標(biāo)和治療策略。
　　Hippo信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及腫瘤發(fā)生有關(guān)，是近來(lái)的研究熱點(diǎn)。在多種腫瘤中Hippo信號(hào)通路成分下調(diào)，其轉(zhuǎn)錄因子YAP1表達(dá)水平是大腸癌重要的預(yù)后因素，Hippo信號(hào)通路負(fù)調(diào)節(jié)YAP1，YAP1作為轉(zhuǎn)錄共激活因子可誘導(dǎo)與細(xì)胞增殖及凋亡有關(guān)的靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，如BIRC5,即survivi

3、n基因，它屬于凋亡蛋白抑制家族成員（IAP）。Hippo/YAP1信號(hào)通路與Wnt/β-catenin信號(hào)通路在維持細(xì)胞穩(wěn)定方面常可相互交叉作用，并與大腸癌細(xì)胞凋亡及增殖有關(guān)。β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路中最重要的轉(zhuǎn)錄共激活因子，可調(diào)節(jié)下游與細(xì)胞增殖、凋亡及分化有關(guān)的靶基因，survivin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靶基因。因此。survivin是Hippo/YAP1及Wnt/β-catenin

4、信號(hào)通路的共同靶基因。本研究的目的是觀察Hippo/YAP1及Wnt/β-catenin信號(hào)通路在大腸癌發(fā)生中的作用及臨床意義以及siRNA沉默YAP1和survivin基因?qū)Υ竽c癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。為此，本研究分為三個(gè)部分。
　　第一部分目的：探討大腸癌組織中YAP1,β-catenin及survivin表達(dá)、相互關(guān)系及臨床意義。
　　方法：采用免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)181例大腸癌組織和30例正常粘膜中YAP1,β-

5、catenin和Survivin的表達(dá)狀況。
　　結(jié)果：1.在181大腸癌組織中， YAP1,β-catenin（細(xì)胞核）及survivin陽(yáng)性率分別為73.5%（133/181），56.9%（103/181）及65.2%（118/181），均明顯高于正常粘膜組(P<0.05)。2.大腸癌組織中YAP1表達(dá)與分化程度、Duke’s分期有關(guān)（P<0.05）；YAP1細(xì)胞核及核/漿表達(dá)與患者的臨床Duke’s分期有關(guān)（P<0.05）。

6、YAP1高表達(dá)與分化程度、Duke’s分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）。β-catenin細(xì)胞核表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床Duke’s分期有關(guān)（P<0.05），β-catenin細(xì)胞膜不完整表達(dá)與組織分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床Duke’s分期等均有關(guān)（P<0.05）。大腸癌組織中Survivin表達(dá)及不同染色定位與患者性別、年齡、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床Duke’s分期等臨床病理因素均無(wú)關(guān)（P>0.05）

7、。3.大腸癌組織中YAP1高表達(dá)與β-catenin細(xì)胞核/漿表達(dá)及survvin表達(dá)有關(guān)（P<0.05）。β-catenin細(xì)胞核表達(dá)與survivin表達(dá)相關(guān)（P<0.05）。4.在82例隨訪病例中，YAP1高表達(dá)、β-catenin細(xì)胞核陽(yáng)性及survivin陽(yáng)性表達(dá)患者5年生存率均明顯低于對(duì)照組（P<0.05）。YAP1,β-catenin（細(xì)胞核）及survivin任何兩者或三者同時(shí)陽(yáng)性者，其5年生存率均明顯低于相對(duì)應(yīng)的對(duì)照組

8、（P<0.05）。
　　結(jié)論：1. Hippo/YAP及Wnt/β-catenin信號(hào)通路在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。2.檢測(cè)YAP1,β-catenin及survivin表達(dá)狀況有助于反映大腸癌的進(jìn)展和預(yù)后。3. Survivin是Hippo/YAP及Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游的共同靶基因；YAP,β-catenin及survivin均有望成為大腸癌基因診斷及基因治療的新靶點(diǎn)。
　　第二部分目的：探討siR

9、NA沉默YAP及Survivin基因后對(duì)人大腸癌細(xì)胞YAP，β-catenin及Survivin表達(dá)、細(xì)胞增殖及凋亡的影響。
　　方法：以脂質(zhì)體Lip-2000為載體，用針對(duì)YAP及Survivin特異靶點(diǎn)的siRNA分別轉(zhuǎn)染入人大腸癌細(xì)胞系RKO、HCT116，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)S-P法、Western Blot檢測(cè)YAP、β-catenin及Survivin蛋白表達(dá)變化；RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)；CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖；流式

10、細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，YAP在轉(zhuǎn)染組陰性或僅見(jiàn)可別細(xì)胞弱陽(yáng)性表達(dá)。siRNA-YAP轉(zhuǎn)染RKO細(xì)胞后β-catenin及Survivin蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。siRNA-survivin轉(zhuǎn)染人大腸HCT116細(xì)胞后，Survivin蛋白表達(dá)明顯降低。Western blot結(jié)果顯示siRNA-YAP轉(zhuǎn)染后，RKO細(xì)胞YAP,β-catenin及Survivin蛋白條帶灰度值

11、明顯低于對(duì)照組（P<0.05）。siRNA-survivin轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞后， Survivin蛋白條帶灰度值明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。RT-PCR結(jié)果顯示，siRNA-YAP轉(zhuǎn)染后，YAP mRNA表達(dá)水平降低約（76.423±9.074%），siRNA-survivin轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞后，survivin mRNA表達(dá)水降低約（69.705±6.151%）（P＜0.05）。CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示siRNA-YAP及si

12、RNA-survivin分別轉(zhuǎn)染RKO及HCT116細(xì)胞后，細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)明顯抑制（P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA-YAP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡比例為23.90±2.07%，siRNA-survivin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡比例為25.73±2.02%，明顯高于對(duì)照組（P<0.01）。
　　結(jié)論：在大腸癌細(xì)胞系中，siRNA-YAP可抑制YAP,β-catenin及Survivin表達(dá)，siRNA-survivin可抑制Surv

13、ivin表達(dá)，兩者均可抑制大腸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；YAP和Survivin有望成為大腸癌基因治療的新靶點(diǎn)。
　　第三部分目的:觀察shRNA-survivin質(zhì)粒對(duì)大腸癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響及其分子機(jī)制。
　　方法：15只3-5周齡雌性裸鼠隨機(jī)分為3組，分別將SW1116細(xì)胞、shRNA對(duì)照組細(xì)胞及shRNA-survivin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞注入裸鼠右側(cè)腋窩皮下組織，建立大腸癌裸鼠移植瘤模型。每?jī)商鞙y(cè)量一次腫瘤大小，計(jì)算腫瘤

14、體積，28天后處死裸鼠并稱腫瘤重量，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。Western blot及 RT-PCR方法檢測(cè)survivin及其下游Ki-67和 BCL-2基因的蛋白及mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：成功建立人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型。shRNA-survivin組移植瘤的大小、重量及體積明顯減小(P<0.05)。與SW1116及shRNA對(duì)照組相比，平均抑留率分別為76.1%及76.3%（P＜0.05）。Western blot及 RT-P

15、CR結(jié)果顯示shRNA-survivin轉(zhuǎn)染組移植瘤組織中survivin及其下游Ki-67, BCL-2基因蛋白及mRNA表達(dá)水平均明顯降低。
　　結(jié)論：shRNA-survivin質(zhì)?？擅黠@抑制survivin及其下游基因Ki-67和BCL-2的表達(dá)，抑制大腸癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Survivin可作為大腸癌治療的靶基因。
　　總之，本研究應(yīng)用多種方法對(duì)大腸癌組織標(biāo)本、細(xì)胞系體內(nèi)及體外進(jìn)行研究，所得結(jié)論概括如下

16、：
　　1.Hippo/YAP及Wnt/β-catenin信號(hào)通路在在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，檢測(cè)YAP1,β-catenin及survivin表達(dá)有助于反映大腸癌的進(jìn)展和預(yù)后。
　　2. Survivin是Hippo/YAP及Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游的共同靶基因。
　　3.在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，siRNA-YAP抑制YAP,β-catenin及Survivin表達(dá)， siRNA-survivin抑制S