SOX9基因沉默對大腸癌細胞系生物學行為的影響.pdf

1、大腸癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一。隨著人類基因組計劃的完成和基因技術的不斷進步,基因治療已成為大腸癌治療的新熱點,并從理論走向實踐,其有效性已在細胞學和動物模型上得到驗證。1998年RNA干擾(RNA interference,RNAi)的發(fā)現(xiàn)[1],特別是在哺乳動物細胞應用小干擾RNA成功介導RNAi,為腫瘤的治療提供了強有力的工具。
　　 對于RNAi在大腸癌基因治療中的應用來講,靶點的選擇是最重要的。SOX9基因是我

2、們實驗室運用生物信息學方法在結直腸癌正常粘膜和其配對癌組織中首次篩選到的一個在大腸癌中表達上調的蛋白,并經(jīng)半定量RT-PCR、實時熒光定量PCR、免疫印跡、免疫組織化學反饋性驗證。同時免疫組織化學結果表明SOX9高表達是一個獨立的預后不良指標[2,3]。另外已有研究支持SOX9是Wnt信號轉導通路的下游基因[4,5],其可能通過抑制細胞分化參與結腸癌的發(fā)生、發(fā)展。因此我們推測SOX9很可能是大腸癌發(fā)生、發(fā)展中一個新的促癌基因。SOX是一

3、類SRY(sex determination region of Y chromosome)相關基因構成的控制發(fā)育的基因家族,編碼一系列SOX家族的轉錄因子,其所有成員的共同特點是含有一個高度保守的HMG-box(highmobilitygroupbox)DNA結合域[6,7]。SOX9可能是目前SOX家族中研究最為廣泛的轉錄因子之一,是人體早期胚胎發(fā)育重要的相關基因,該基因的突變或重復可導致性別反轉或CD綜合癥[8,9]。近年來研究發(fā)

4、現(xiàn)SOX9在脊椎動物的發(fā)育過程中起著重要作用[10],尤其在骨骼、生殖腺、神經(jīng)膠質以及心臟的發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能,同時SOX9的異常表達可能與人類多種腫瘤有關,研究顯示SOX9在大腸癌[11-13]、軟骨肉瘤[14,15]、前列腺癌[16-18]、乳腺癌[19-23]、卵巢癌[24-25]、肺癌[26-27]、基底細胞癌[28]、膀胱癌[29]及黑色素瘤[30,31]等腫瘤組織中表達異常,并與腫瘤細胞的增殖分化、侵襲轉移、凋亡等密切相

5、關。
　　 SOX9在結直腸癌組織中的表達相對于正常組織來說較高,并且結直腸癌細胞系中SOX9的表達也較高,這個現(xiàn)象可能預示著SOX9表達升高可能與腫瘤的發(fā)生相關。這個現(xiàn)象給了我們一個思路:將高表達SOX9的結直腸癌細胞通過RNAi方法使得SOX9的表達降低后,這些細胞會產(chǎn)生怎樣的變化?我們選用了具備不同遺傳學背景的SW480和RKO細胞作為我們的細胞模型。本實驗通過構建SOX9干擾質粒載體、轉染細胞及穩(wěn)篩的方法沉默結直腸癌細胞

6、中SOX9的表達,并分別對SW480和RKO的空白對照組(B)、空質粒組(E)及轉染組(S)的生物學行為進行了檢測分析,包括細胞增殖實驗、凋亡相關檢測、遷移實驗,并建立裸鼠人大腸癌移植模型,體內評價SOX9基因沉默對大腸癌實體瘤的靶向抑瘤效果,為SOX9作為臨床基因治療新靶點提供理論依據(jù).
　　 MTT實驗結果分析顯示:轉染了SOX9干擾質粒的SW480和RKO細胞的生長速度要明顯慢于空白對照組和轉染空載體對照組。并且通過實時定

7、量儀檢測細胞增殖速度,同樣得到RKOS和SW480S組細胞相對于對照組增殖速度減慢。提示細胞中SOX9表達上調后可能通過加快細胞的增殖速率促進腫瘤的形成。
　　 PI/AnnexinV雙染的流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn):轉染了SOX9干擾質粒的SW480和RKO細胞凋亡率都明顯增高,提示SOX9的沉默在結直腸癌細胞中可以誘導細胞的凋亡。
　　 細胞遷移實驗表明:SOX9對結直腸癌SW480的遷移能力沒有影響。
　　 裸鼠成