慢病毒導(dǎo)入的PLC-gamma1 SiRNA對(duì)人大腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、大腸癌是世界上比較常見(jiàn)的癌癥之一，其發(fā)病率在全球惡性腫瘤中排第四位，每年約有四十萬(wàn)男性和三十八萬(wàn)女性患此病，每年死于本病的患者約三十九萬(wàn)人，相對(duì)生存率不到百分之四十。在發(fā)展中國(guó)家其發(fā)病率也逐年上升，在我國(guó)大腸癌在胃腸道腫瘤中已位列第三。然而對(duì)于大腸癌的發(fā)病機(jī)理還不是很清楚，有很多的文獻(xiàn)報(bào)道在大腸癌細(xì)胞中PLC-gammal的表達(dá)在mRNA和蛋白質(zhì)水平都明顯地增高，但是還不了解PLC-gammal在大腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所起的作用。鑒定出P

2、LC-gammal所調(diào)節(jié)的信號(hào)分子及在大腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所起的作用對(duì)于其發(fā)生機(jī)制的了解是十分重要的，同時(shí)可進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)抗腫瘤藥物的靶蛋白，對(duì)于大腸癌的治療具有一定的意義。 PLC-gammal，磷脂酶C(phosholipaseC，PLC)的一個(gè)亞型，是磷脂代謝的關(guān)鍵酶之一，在不同的細(xì)胞過(guò)程如細(xì)胞的增殖、分化、和運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)中都有PLC-gammal的參與。PLC-gammal含有兩個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域、一個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域和另一個(gè)PH結(jié)構(gòu)

3、域，通過(guò)與多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞活素、膜受體的免疫球蛋白相聯(lián)而被激活。PLC-gammal被激活后可以水解PIP2產(chǎn)生兩個(gè)胞內(nèi)信使，PIP3(1，4，5)和二磷脂酰甘油。PIP3(1，4，5)可以使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)釋放出鈣離子，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度，而二磷脂酰甘油則可以激活PKC，起始下游一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而參與對(duì)多種生命活動(dòng)過(guò)程的調(diào)節(jié)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究報(bào)道PLC-gammal與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，然而PLC-gammal在

4、大腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用還并不清楚。傳統(tǒng)研究PLC-gammal的方法存在著很大的局限性和不客觀性，如用U73122對(duì)PLC-gammal進(jìn)行抑制，它屬于PLC的特異抑制劑，在抑制了PLC-gammal的同時(shí)也抑制了PLC其它亞型的活性，這使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果很難解釋?zhuān)狈陀^性。另外運(yùn)用含有SH2，SH3和一個(gè)inhibitory(Ⅰ)結(jié)構(gòu)域的顯性負(fù)突變片段PLCZ的表達(dá)來(lái)抑制PLC-gammal的表達(dá)，理論上雖然可行，但是由于蛋白質(zhì)翻譯后

5、的修飾和加工機(jī)制，因此在真核細(xì)胞中蛋白的表達(dá)需要一個(gè)很有效的蛋白表達(dá)系統(tǒng)才行，并且還會(huì)受到很多因素的限制和影響。近年來(lái)的研究表明，一些小的雙鏈RNA可以高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)，促使mRNA降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，可作為一種抑制細(xì)胞中某個(gè)基因表達(dá)的有力工具。 本課題以大腸癌細(xì)胞為研究模型，利用RNA干涉技術(shù)等手段，研究了PLC-gammal與大腸癌細(xì)胞多種生物學(xué)行為的關(guān)系，以期全面地揭示PLC-gamma

6、l在大腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所起的作用，為尋找治療的靶位點(diǎn)和大腸癌的基因治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究首先合成特異性干擾PLC-gammal的ShRNA分子，并與入門(mén)載體pENTRTM/U6連接，使PLC-gammal的ShRNA分子克隆到啟動(dòng)子U6的下游，然后與病毒載體pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST在att位點(diǎn)重組，在三種包膜載體pLP1，pLP2，pLP/VSVG的存在下，用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293FT

7、以獲得重組的慢病毒，然后用重組的慢病毒感染LoVo細(xì)胞并以殺稻瘟菌素篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。應(yīng)用Western印跡方法和RT-PCR對(duì)細(xì)胞中PLC-gammal的蛋白和mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析，XTT法和黏附能力測(cè)定，轉(zhuǎn)移能力測(cè)定和凋亡測(cè)定分別檢測(cè)PLC-gammal對(duì)細(xì)胞增殖、黏附、運(yùn)動(dòng)和凋亡的影響。 本實(shí)驗(yàn)的主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1.成功構(gòu)建了人源PLC-gammalsiRNA真核表達(dá)的重組載體，所構(gòu)建的載體經(jīng)瓊脂糖凝膠

8、電泳，DNA序列測(cè)定證明是正確的。然后重組體在三種包膜載體pLP1，pLP2，pLP/VSVG的存在下，經(jīng)脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293FT以獲得重組的慢病毒，然后用重組的慢病毒感染LoVo細(xì)胞并以殺稻瘟菌素篩選出了穩(wěn)定表達(dá)PLC-gammalsiRNA細(xì)胞系，分別命名：LoVo/Lenti6-GW/U6-PLC-gammalshRNAconstruc(簡(jiǎn)稱(chēng)PL61)和LoVo/non-specificconstruct(簡(jiǎn)稱(chēng)PL41

9、)，經(jīng)Western印跡方法和RT-PCR分析顯示，與正常的LoVo細(xì)胞和non-specificconstruct的重組病毒感染的LoVo細(xì)胞相比，重組Lenti6-GW/U6-PLC-gammalshRNAconstruct病毒在蛋白和mRNA水平上顯著地抑制了PLC-gammal的表達(dá)。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了人源PLC-gammalsiRNA真核表達(dá)的重組載體并制備出了重組慢病毒，篩選出了穩(wěn)定敲低PLC-gammal表達(dá)的細(xì)胞系

10、，從而為進(jìn)一步研究PLC-gammal在大腸癌發(fā)生發(fā)展中所起的作用奠定了基礎(chǔ)。 2.報(bào)告基因分析顯示，PLC-gammal的穩(wěn)定敲低并沒(méi)有影響報(bào)告基因LamininA/C的表達(dá)，這說(shuō)明敲低PLC-gammal的表達(dá)在本實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有產(chǎn)生影響報(bào)告基因表達(dá)的非特異性反應(yīng)，慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾效應(yīng)是能夠特異性地抑制內(nèi)源性PLC-gammal的表達(dá). 3.PLC-gammal的高表達(dá)顯著地促進(jìn)大腸癌細(xì)胞與基質(zhì)的黏附。黏附分析顯示，

11、以正常的LoVo細(xì)胞作為對(duì)照組，相對(duì)于對(duì)照組來(lái)說(shuō)，重組的Lenti6-GW/U6-PLCgammalshRNAconstruct病毒導(dǎo)入的LoVo細(xì)胞和non-specificconstruct的重組病毒導(dǎo)入的LoVo細(xì)胞的黏附數(shù)據(jù)以百分比的形式表現(xiàn)出來(lái)，與對(duì)照組相比，non-specificconstruct的重組病毒導(dǎo)入的LoVo細(xì)胞黏附能力基本不變，重組的Lenti6-GW/U6-PLCgammalshRNAconstruct病毒

12、導(dǎo)入的LoVo細(xì)胞黏附能力顯著下降。OD570從對(duì)照組的1.863±0.075分別下降為1.689±0.121，0.098±0.002(P＜0.05)。結(jié)果提示在大腸癌細(xì)胞中PLC-gammal的高表達(dá)能顯著地促進(jìn)細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附作用。 4.PLC-gammal的高表達(dá)顯著地促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的遷移能力。本實(shí)驗(yàn)采用體外損傷愈合分析進(jìn)一步研究了PLC-gammal對(duì)LoVo細(xì)胞體外遷移能力的影響。結(jié)果顯示，重組的Lenti6-GW/

13、U6-PLCgammalshRNAconstruct病毒導(dǎo)入的LoVo細(xì)胞遷移率顯著下降。與對(duì)照組遷移率(100％)相比，Lenti6-GW/U6-PLCgammalshRNAconstruct病毒導(dǎo)入的LoVo細(xì)胞和non-specificconstruct的重組病毒導(dǎo)入的LoVo細(xì)胞的遷移率(實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞書(shū)/對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù))％分別降到17.63±0.95％，86.71±2.93％，和對(duì)照組和non-specificconstru

14、ct的重組病毒導(dǎo)入的LoVo細(xì)胞相比，重組的Lenti6-GW/U6-PLCgammalshRNAconstruct病毒導(dǎo)入的LoVo細(xì)胞遷移能力顯著下降(P＜0.05)。說(shuō)明在大腸癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中，PLC-gammal的高表達(dá)可顯著地促進(jìn)細(xì)胞的遷移能力，使細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增加，促進(jìn)了大腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。 5.PLC-gammal的高表達(dá)顯著地增加了大腸癌細(xì)胞抗凋亡的能力。5-FU誘導(dǎo)的凋亡分析顯示，pENTR/U6/PLC-gamma

15、lshRNAconstruct的重組病毒導(dǎo)入的LoVo細(xì)胞的凋亡比率達(dá)到30％-40％，蛋白印跡分析顯示，在15umol/ml的5-FU處理后，由于PLC-gammal的敲低，Bcl-2和caspase-3的表達(dá)也降低，使得內(nèi)在和外在的凋亡通路均被啟動(dòng)。而在LoVo細(xì)胞和non-specificconstruct的重組病毒導(dǎo)入的LoVo細(xì)胞中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的凋亡(＜10％)，Bcl-2和caspase-3的表達(dá)無(wú)明顯改變。說(shuō)明在大腸癌中

16、，內(nèi)源性的PLC-gammal的高表達(dá)是使得腫瘤具有抗凋亡特性的一個(gè)主要因素之一。 6.PLC-gammal的高表達(dá)對(duì)大腸癌細(xì)胞的增殖無(wú)顯著地影響。細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)顯示，和LoVo細(xì)胞和non-specificconstruct的重組病毒導(dǎo)入的LoVo細(xì)胞相比，PLC-gammal表達(dá)的長(zhǎng)期抑制并沒(méi)有降低細(xì)胞的增殖率，而且cyclinDlandCDK4的表達(dá)也沒(méi)有隨著PLC-gammal表達(dá)的降低而有所改變。說(shuō)明內(nèi)源性的PLC-g