FHL2在牙胚發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)及作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的:
　　 牙胚發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的、多因素參與的過程，它是上皮和間充質(zhì)細(xì)胞之間相互作用的結(jié)果。在牙胚發(fā)育的過程中，多種生長因子相互作用，共同調(diào)控細(xì)胞分化及牙體硬組織的形成。但牙胚發(fā)育的確切機(jī)制尚未研究清楚，可能還有很多信號分子參與到這一過程。
　　 FHL2(FourandahalfLIMdomains2)是LIM蛋白家族LIM-only亞類中的一員，它是一種轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子。FHL2蛋白的分子結(jié)構(gòu)中含有4個(gè)半LIM結(jié)構(gòu)域

2、，共含有279個(gè)氨基酸。它通過LIM結(jié)構(gòu)域與某些受體、激酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等多種蛋白相互作用，對基因表達(dá)、細(xì)胞分化、形態(tài)發(fā)生及硬組織的形成等發(fā)揮重要的調(diào)控作用。FHL2的表達(dá)具有細(xì)胞類型特異性，在不同的組織和細(xì)胞中，F(xiàn)HL2作為轉(zhuǎn)錄共激活子或抑制子升高或降低轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL2在骨組織的形成中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。FHL2蛋白作為重要的轉(zhuǎn)錄共激活子，可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化及骨組織的形成。
　　 骨與牙本質(zhì)都

3、是硬組織，而且成骨細(xì)胞及成牙本質(zhì)細(xì)胞都來源于間充質(zhì)細(xì)胞，基因表達(dá)上存在很多相似性。因此我們推測FHL2在牙胚發(fā)育、成牙本質(zhì)細(xì)胞分化及牙本質(zhì)的形成中可能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。
　　 在牙胚發(fā)育中，Runx2作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞分化，基質(zhì)分泌等過程中可以通過調(diào)控相關(guān)目的基因的表達(dá)來促進(jìn)牙胚發(fā)育和硬組織形成。在成骨細(xì)胞分化及骨組織的形成過程中，F(xiàn)HL2可直接或通過Wnt/β-catenin途徑提高轉(zhuǎn)錄因子Runx2的轉(zhuǎn)錄活性。因此我們推

4、測FHL2可能通過激活轉(zhuǎn)錄因子Runx2的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控牙胚發(fā)育、細(xì)胞分化及硬組織的形成。
　　 根據(jù)以上推測，本課題分為三個(gè)實(shí)驗(yàn):
　　 實(shí)驗(yàn)一:利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測FHL2在小鼠第一磨牙牙胚發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)，初步分析FHL2蛋白在牙胚發(fā)育中的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示FHL2在小鼠第一磨牙發(fā)育過程中呈現(xiàn)時(shí)空特異性表達(dá)。在蕾狀期和帽狀期，F(xiàn)HL2表達(dá)于成釉器和周圍的間充質(zhì)細(xì)胞。在鐘狀早期，F(xiàn)HL2表達(dá)于內(nèi)釉上皮、外釉上皮

5、和中間層，而在星網(wǎng)狀層中無表達(dá)，并且FHL2逐漸表達(dá)于與內(nèi)釉上皮相接觸的牙乳頭細(xì)胞。在鐘狀晚期，F(xiàn)HL2表達(dá)于已分化成熟的成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞，在細(xì)胞分泌的有機(jī)基質(zhì)中也呈陽性表達(dá)。在P2.5天，P5天，F(xiàn)HL2表達(dá)于成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙釉質(zhì)中，而在前期牙本質(zhì)和牙本質(zhì)中無表達(dá)。到P7天，F(xiàn)HL2逐漸表達(dá)于上皮根鞘及根分叉處的牙本質(zhì)中，在成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙釉質(zhì)中仍然呈陽性表達(dá)。在P13.5天，F(xiàn)HL2表達(dá)于縮余釉上皮、牙冠及

6、牙根成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙周膜及牙槽骨中。在P21、P28天，F(xiàn)HL2表達(dá)于牙齦上皮、成牙本質(zhì)細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞、牙周膜及牙槽骨中，在根尖乳頭細(xì)胞中也呈強(qiáng)陽性表達(dá)。因此，在牙胚發(fā)育過程中，F(xiàn)HL2可能對牙胚發(fā)育、細(xì)胞分化、形態(tài)發(fā)生及硬組織基質(zhì)的分泌與礦化有重要的調(diào)節(jié)作用。
　　 實(shí)驗(yàn)二:利用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)定位FHL2及Runx2在早期牙胚發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)，初步探討FHL2在牙胚發(fā)育過程中與Runx2的關(guān)系。結(jié)果顯示FHL2與Ru

7、nx2在牙胚發(fā)育的早期共同呈現(xiàn)時(shí)空特異性表達(dá)。在蕾狀期和帽狀期，F(xiàn)HL2和Runx2都表達(dá)于成釉器及周圍的間充質(zhì)細(xì)胞中。FHL2大部分表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，少部分表達(dá)于細(xì)胞核，而Runx2全部表達(dá)于細(xì)胞核中。在鐘狀早期，F(xiàn)HL2和Runx2同時(shí)表達(dá)于內(nèi)釉上皮、外釉上皮、中間層，而在星網(wǎng)狀層中無表達(dá)。在與內(nèi)釉上皮相接觸的牙乳頭細(xì)胞中，F(xiàn)HL2和Runx2也都有表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)三:利用WesternBlot技術(shù)檢測FHL2及Runx2在

8、人牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中表達(dá)水平的變化。利用免疫共沉淀技術(shù)檢測FHL2在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中與Runx2的相互作用。結(jié)果顯示在礦化誘導(dǎo)0、7、14天的牙髓細(xì)胞中，F(xiàn)HL2和Runx2都有表達(dá)。FHL2蛋白的表達(dá)量逐漸上升，而Runx2在礦化誘導(dǎo)7天時(shí)，蛋白的表達(dá)量最高。免疫共沉淀顯示在不同的礦化時(shí)期，F(xiàn)HL2與Runx2都有直接的相互作用。
　　 實(shí)驗(yàn)二和實(shí)驗(yàn)三結(jié)果提示:FHL2作為轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子，可能通過提高轉(zhuǎn)錄因