FHL2參與調(diào)節(jié)KLF8促進(jìn)結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究.pdf

1、南方醫(yī)科大學(xué)2 0 1 2 級碩士學(xué)位論文F H L 2 參與調(diào)節(jié)K L F 8 促進(jìn)結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究K L F 8 p r o m o t e s t u m o r i g e n e s i s ，i n v a s i o na n d m e t a s t a s i s o fc o l o r e c t a l c a n c e r c e l l sb y t r a n s c r i p t i o

2、n a l a c t i v a t i o no fF H L 2課題來源： 國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( 8 1 2 7 2 7 6 1 )國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( 8 1 1 7 2 0 5 7 )南方醫(yī)院院長基金( 2 0 1 2 8 0 0 9 )南方醫(yī)院院長基金( 2 0 1 3 2 0 0 8 )學(xué)位申請人 嚴(yán)清青導(dǎo) 師 姓 名 王繼德教授 劉思德教授專 業(yè) 名 稱 內(nèi)科學(xué)( 消化系病)培 養(yǎng) 類 型 學(xué)術(shù)型培 養(yǎng) 層

3、次 全日制碩士研究生所 在 學(xué) 院 第一臨床醫(yī)學(xué)院答 辯主席 曾志榮教授答辯 委員 岳輝教授張北平教授楊定華教授白 嵐教授2 0 1 5 年3 月2 0 日 廣州摘要1 ．1 K L F 8 過表達(dá)穩(wěn)定株的構(gòu)建及K L F 8 對腸癌E M T 的影響轉(zhuǎn)染p c D N A 3 ．1 一K L F 8 和對照p c D N A 3 ．1 質(zhì)粒到L o v o 細(xì)胞，4 8 小時(shí)后用含有6 0 0 p g ／m l G 4 1 8 的培養(yǎng)

4、基繼續(xù)培養(yǎng)2 周，挑選單克隆細(xì)胞，并用8 0 0 p g ／m lG 4 1 8培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，建立單克隆穩(wěn)定表達(dá)株，w e s t e r nb l o t 驗(yàn)證穩(wěn)定克隆細(xì)胞中K L F 8 的表達(dá)情況。w e s t e r n b l o t 檢測轉(zhuǎn)染p c D N A 3 ．1 ．K L F 8 和對照p c D N A 3 ．1 質(zhì)粒細(xì)胞中的E —e a d h e r i n 、V i m e n t i n 及N —c a

5、 d h e n r i n 的表達(dá)情況。1 ．2K L F 8 對腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響接種適當(dāng)密度轉(zhuǎn)染p c D N A 3 ．1 一K L F 8 和對照p c D N A 3 ．1 質(zhì)粒細(xì)胞至6 孔板中，待融合度近1 0 0 ％時(shí)，用移液器槍頭進(jìn)行劃痕，鏡下記錄劃痕區(qū)相對距離，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于1 2 和2 4 小時(shí)再次拍照記錄，評估腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力；種轉(zhuǎn)染p c D N A 3 ．1 ．K L F 8 和對照p c D N A

6、 3 ．1 質(zhì)粒的單細(xì)胞懸液( 5 ×1 0 5 ／室) 至M a t r i g e l 侵襲小室，室內(nèi)為無血清培養(yǎng)基，室外為l O ％l f l 牛血清培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)2 4 小時(shí)，0 ．2 ％結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)量，評價(jià)高表達(dá)K L F 8 對細(xì)胞侵襲能力的影響。1 ．3 r T G F ．B 1 對K L F 8 及E M T 的影響w e s t e r n b l o t 檢測不同濃度( 0 、

7、0 ．5 、1 ．0 、2 ．0 n g ／m 1 ) r T G F - D 1 處理L o v o 細(xì)胞后蛋白中K L F 8 、E ．c a d h e r i n 和v i m e n t i n 的表達(dá)。用含有2 ¨g ／m l T G F —p 1 的中和抗體及對照正常鼠I g G 抗體( n o r m a lm o u s e I g G ，m l g G ) 的培養(yǎng)基孵育S W 4 8 0細(xì)胞過夜，第二天分I

8、 I ；I I 或不加r T G F ．1 3 1 ( 2 n g ／m 1 ) 刺激，繼續(xù)孵育4 8 小時(shí)，w e s t e m b l o t 方法檢測K L F 8 、E —c a d h e r i n 和v i m e n t i n 的表達(dá)。轉(zhuǎn)染K L F 8 ．s i R N A和對照S c r ．s i R N A 入L o v o 細(xì)胞，2 4 小時(shí)后加或不加r T G F ．B 1 ，繼續(xù)孵育4 8 小時(shí)，w e

9、s t e r n b l o t 檢測K L F 8 、E ．c a d h e r i n 和v i m e n t i n 的表達(dá)。2 ．K L F 8 和F H L 2 在原發(fā)性腸癌、轉(zhuǎn)移癌組織及細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況2 ．1K L F 8 和F H L 2 在原發(fā)性腸癌及轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)收集1 5 對以上來自同一腸癌病人的原發(fā)與轉(zhuǎn)移癌( 淋巴結(jié)或肝轉(zhuǎn)移) 手術(shù)標(biāo)本，在連續(xù)切片中分別應(yīng)用K L F 8 和F H L 2 抗體進(jìn)行免疫