β-catenin在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其相關(guān)分子機制研究.pdf

1、第一部分結(jié)直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin表達與同時性肝轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究
　　 研究背景與目的:結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)結(jié)直腸癌發(fā)病率每年以2％的速度增長。盡管隨著診療技術(shù)的不斷進步結(jié)直腸癌患者預(yù)后有了很大改善，但病死率仍居高不下。結(jié)直腸癌患者病死的主要原因是局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移，結(jié)直腸癌最常見的遠處轉(zhuǎn)移臟器是肝臟。據(jù)文獻報道，無肝轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者五年生存率接近90％，而發(fā)生肝轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者五年生

2、存率僅為19％。結(jié)直腸癌患者在確診時，有20％～40％的患者已發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，結(jié)直腸癌根治性手術(shù)后發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的患者達50％，結(jié)直腸癌死亡患者中有肝臟轉(zhuǎn)移者比例占45％～71％。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的早期預(yù)測及診斷對指導(dǎo)治療，改善患者預(yù)后有重要的意義。人們做了大量工作研究影響直腸癌肝轉(zhuǎn)移的危險因素。就組織病理而言，血管浸潤、腫瘤浸潤深度、腫瘤細胞低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等是結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的危險因素；從分子生物學來看，已經(jīng)證明與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移有關(guān)的生物分子

3、有表皮生長因子(EGF)、肌動蛋白相關(guān)蛋白2(Arp2)、轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)、分化抗原簇44(CD44)和分化抗原簇10(CD10)等。
　　 腫瘤浸潤前沿(ITF)是指位于腫瘤與宿主組織或器官交界處最前沿的3～6層腫瘤細胞或分散的細胞團，研究腫瘤浸潤前沿細胞的特點對于了解腫瘤的生物學特性、指導(dǎo)腫瘤治療及評詁預(yù)后有十分重要的作用。結(jié)直腸癌浸潤前沿表現(xiàn)為腫瘤細胞低分化，伴隨上皮表型缺失以及獲得間質(zhì)表型，從而有利于腫瘤侵襲

4、轉(zhuǎn)移，這個過程即腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。結(jié)直腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的一個重要分子是β-連環(huán)素(β-catenin)。β-catenin是一種分子量為90kD多功能蛋白質(zhì)，它與E-黏附素(E-cadherin)的胞漿端相連構(gòu)成E-cadherin/β-catenin復(fù)合物，參與構(gòu)成細胞間粘附連接，對于維持上皮的極性和完整性有重要作用；β-catenin又是Wnt信號途徑的下游元件，在Wnt信號的刺激下，β-catenin的磷酸化受到抑制

5、，使胞漿中β-catenin水平升高，β-catenin進入核內(nèi)，調(diào)節(jié)靶基因的表達，當Wnt信號異常激活可引起細胞增殖分化的異常。文獻報道，腫瘤細胞核β-catenin表達變化與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移有關(guān)。最近的研究表明，結(jié)直腸癌浸潤前沿β-catenin mRNA表達明顯增加，細胞核和細胞漿β-catenin表達亦伴隨增加。上述資料提示，β-catenin在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。
　　 基于以往的研究報道，認為結(jié)直腸癌浸潤

6、前沿細胞核β-catenin高表達可能在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。觀察了細胞核β-catenin在結(jié)直腸癌浸潤前沿和肝轉(zhuǎn)移灶的表達，明確二者有無聯(lián)系。同時，還研究了結(jié)直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin表達與臨床病理特征的關(guān)系，明確結(jié)直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin表達與同時性肝轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　 方法:收集486例結(jié)直腸癌患者的原發(fā)癌組織和轉(zhuǎn)移瘤標本以及相關(guān)臨床資料，其中包括144例發(fā)生同時性肝轉(zhuǎn)移患者。采用免疫

7、組織化學法檢測β-catenin在結(jié)直腸癌組織和肝轉(zhuǎn)移灶的表達。采用x2檢驗比較結(jié)直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin表達在有肝轉(zhuǎn)移患者和無肝轉(zhuǎn)移患者之間的差別；采用spearman相關(guān)分析分析結(jié)直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin表達與肝轉(zhuǎn)移灶細胞核β-catenin表達有無關(guān)系；x2檢驗分析結(jié)直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin表達與臨床病理特征的關(guān)系；單因素和logistic多因素回歸分析分析結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的危險因素。

8、>　　 結(jié)果:
　　 1.所有結(jié)直腸癌患者組織標本中均能觀察到β-catenin表達，在無肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌的浸潤前沿和腫瘤中心β-catenin表達以胞膜型為主；在有肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌的浸潤前沿β-catenin表達以胞核型為主。結(jié)直腸癌組織浸潤前沿細胞核β-catenin過表達在有肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者較無肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者更明顯(71.5％vs.29.3％；P<0.001)。
　　 2.Spearman相關(guān)分析顯示發(fā)

9、生結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移的患者結(jié)直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin表達與肝轉(zhuǎn)移灶細胞核β-catenin表達有顯著相關(guān)性。
　　 3.x2檢驗結(jié)果顯示結(jié)直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin表達與年齡(P<0.001)、病理組織類型(P=0.01)、浸潤深度(P<0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.021)、肝轉(zhuǎn)移(P<0.001)及結(jié)直腸癌TNM分期(P<0.001)有關(guān)。
　　 4.x2檢驗顯示，結(jié)直腸癌同時性肝轉(zhuǎn)移與年齡(

10、P=0.01)、腫瘤大小(P<0.001)、腫瘤分化程度(P<0.001)、浸潤深度(P<0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)及浸潤前沿細胞核β-catenin過表達(P<0.001)有關(guān)。
　　 5.Logistic多因素回歸分析提示，年齡(P=0.003)、腫瘤大小(P<0.001)、浸潤深度(P=0.001)、腫瘤分化程度(P=0.031)及浸潤前沿細胞核β-catenin過表達(P<0.001)是結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移獨立

11、危險因素。
　　 結(jié)論:
　　 1.發(fā)生結(jié)直腸同時性肝轉(zhuǎn)移患者結(jié)直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin過表達更為明顯。
　　 2.發(fā)生結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移的患者結(jié)直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin表達與肝轉(zhuǎn)移灶細胞核β-catenin表達呈正相關(guān)關(guān)系。
　　 3.結(jié)直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin表達與年齡、腫瘤病理類型、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)。
　　 4.結(jié)直腸癌同時性肝

12、轉(zhuǎn)移與年齡、腫瘤大小、腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤前沿細胞核β-catenin表達有關(guān)；年齡、腫瘤大小、腫瘤分化程度、浸潤深度和浸潤前沿細胞核β-catenin過表達是結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的獨立危險因素。
　　 5.結(jié)直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin過表達與同時性肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，細胞核β-catenin過表達可能是一個有價值的預(yù)測肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測因子。
　　 意義:結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的重要因素，

13、結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的早期預(yù)測及診斷對指導(dǎo)治療，改善患者預(yù)后有重要的意義。該研究是基于臨床和病理資料來闡明結(jié)直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin過表達與同時性肝轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究。本研究的臨床意義在于，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin過表達與同時性肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提供了一個可能有效預(yù)測結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測因子。
　　 第二部分 CXCR4/SDF-1信號通路對結(jié)腸癌HT29細胞E-cadhor i n/β-catenin復(fù)合

14、物表達的影響及其機制研究
　　 研究背景與目的:結(jié)直腸癌患者主要的死亡原因是局部復(fù)發(fā)和肝臟轉(zhuǎn)移，人們對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的機制進行了大量研究。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的步驟包括腫瘤細胞粘附性能的改變、腫瘤細胞脫離原發(fā)灶并降解細胞外基質(zhì)、腫瘤細胞局部浸潤及脈管浸潤、腫瘤細胞在循環(huán)中播散和免疫逃逸、腫瘤細胞血管內(nèi)栓塞、腫瘤細胞在新的微環(huán)境重新生長及腫瘤血管生成等。每一個步驟都涉及多種分子事件，研究這些分子事件有助于理解結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移機制，并為結(jié)直

15、腸癌肝轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。
　　 目前對于腫瘤轉(zhuǎn)移機制的解釋有3種學說，即“種子與土壤”學說、“解剖-機械”學說和“信號或歸巢”學說。“信號或歸巢”學說認為腫瘤細胞高表達特異的趨化因子受體，宿主器官則表達其相應(yīng)的趨化因子配體，腫瘤細胞借助趨化因子配體與其受體的特異性結(jié)合力，實現(xiàn)組織器官的特異性轉(zhuǎn)移?！靶盘柣驓w巢”學說最初用于解釋造血干細胞特異性歸巢于骨髓，2001年Muller等首次發(fā)現(xiàn)，人乳腺癌組織中和乳腺癌細胞系高

16、表達趨化因子受體CXCR4，而在乳腺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位如淋巴結(jié)、肺、肝臟和骨髓等部位則高表達其配體基質(zhì)衍生因子-1(SDF-1)，并且從這些組織提取的蛋白對乳腺癌細胞有明顯的趨化作用，說明SDF-1及其受體在決定乳腺癌轉(zhuǎn)移部位上起著非常重要的作用。
　　 SDF-1屬于趨化因子CXC亞家族，CXCR4為G蛋白偶聯(lián)的跨膜受體蛋白超家族中的一員，是SDF-1的唯一受體。前已知超過23種人類的惡性腫瘤細胞有CXCR4表達，CXCR4/

17、SDF-1生物軸在乳腺癌、惡性黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、食管癌等腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用也得到證實。近年來很多研究報道指出趨化因子SDF-1與其特異性受體CXCR4在結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。
　　 E-cadherin是定位于細胞間粘附連接的一次跨膜單鏈糖蛋白，相鄰細胞E-cadherin的胞外域可相互結(jié)合形成拉鏈樣結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)同型細胞間連接。E-cadherin漿內(nèi)部分通過α、β、γ-catenin與細胞骨

18、架結(jié)合，構(gòu)成cadherin-catenin復(fù)合物，介導(dǎo)細胞粘附和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與調(diào)節(jié)組織發(fā)生和形態(tài)分化，對細胞識別、遷移、歸類等行為發(fā)揮重作用。研究表明，E-cadherin/β-catenin復(fù)合物與結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。
　　 前面的研究表明，β-catenin與結(jié)直腸癌同時性肝轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，基于研究發(fā)現(xiàn)和以往對CXCR4/SDF-1信號通路及E-cadherin/β-catenin復(fù)合物與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究，

19、認為CXCR4/SDF-1信號通路與E-cadherin/β-catenin復(fù)合物之間可能存在聯(lián)系。本研究檢測了SDF-1對結(jié)腸癌HT29細胞系E-cadherin/β-catenin復(fù)合物表達的影響。同時，還檢測了E-cadherin/β-catenin mRNA水平的變化及磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)和β-catenin磷酸化變化，探討CXCR4/SDF-1信號通路影響E-cadherin/β-catenin復(fù)合物

20、表達可能的分子機制。
　　 方法:
　　 1.MTT法檢測SDF-1對結(jié)腸癌HT29細胞增殖的影響。
　　 2.Transwell體外侵襲實驗檢測SDF-1對HT29細胞侵襲能力的影響。
　　 3.免疫細胞化學法檢測SDF-1對HT29細胞E-cadherin和β-catenin表達的影響。
　　 4.反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測SDF-1對HT29細胞E-cadherin mRNA和β-ca

21、tenin mRNA表達的影響。
　　 5.蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測HT29細胞PI3K/AKT和β-catenin磷酸化變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.SDF-1作用于HT29細胞48h后，各組增殖并無明顯差異。72h后20ng/mL和40ng/mLSDF-1組HT29細胞增殖較對照組明顯增加，增殖率分別為129％和135％，統(tǒng)計學上有顯著性差異。而預(yù)先用AMD3100處理過的HT

22、29細胞，SDF-1促進增殖的作用不明顯，單獨用AMD3100處理的HT29細胞增殖與對照組無差別。
　　 2.SDF-1作用于HT29細胞24h后10ng/mL、20ng/mL和40ng/mL3組遷移細胞較對照組(92.3±12.4)均明顯增加，遷移細胞數(shù)分別為149±13.3(P=0.041)，161±13.5(P=0.023)和187.5±14(P(0.001)。預(yù)先用AMD3100處理過的HT29細胞侵襲能力無明顯變化，

23、單獨用AMD3100處理的HT29細胞遷移細胞與對照組無差別。
　　 3.免疫細胞化學檢測顯示SDF-1作用48h后，20ng/mL組和40ng/mL組HT29細胞E-cadherin表達較對照組顯著下降。而預(yù)先用AMD3100處理過的HT29細胞，SDF-1作用后未見E-cadherin表達下降。單獨用AMD3100處理HT29細胞E-cadherin表達亦未出現(xiàn)明顯變化。
　　 RT-PCR分析顯示，20ng/mL和

24、40ng/mLSDF-1作用HT29細胞48h后，E-cadherin mRNA水平顯著下降。預(yù)先用AMD3100處理過的HT29細胞，SDF-1作用后未見E-cadherin mRNA表達下降，單獨用AMD3100處理的HT29細胞E-cadherin mRNA表達亦未出現(xiàn)明顯變化。
　　 4.免疫細胞化學檢測顯示，20ng/mL組和40ng/mL組SDF-1處理48h后HT29細胞的β-catenin表達均顯著下降。盡管預(yù)先

25、用AMD3100處理過的HT29細胞經(jīng)SDF-1作用48h后β-catenin表達亦有所下降，但差異不明顯。單獨用AMD3100處理的HT29細胞β-catenin表達亦未出現(xiàn)明顯變化。
　　 RT-PCR分析顯示，SDF-1作用48h后，20ng/mL組和40ng/mL組HT29細胞β-catenin mRNA水平均顯著下降。預(yù)先用AMD3100處理過的HT29細胞SDF-1作用后未見β-catenin mRNA表達下降，單獨

26、用AMD3100處理的HT29細胞β-catenin mRNA水平亦未出現(xiàn)明顯變化。
　　 5.SDF-1(20ng/mL)作用HT29細胞1min后，PI3K/AKT和β-catenin即發(fā)生磷酸化變化，β-catenin磷酸化在第5min時明顯增強，而PI3K/AKT磷酸化則在第15min時明顯增強。β-catenin磷酸化高峰出現(xiàn)在第30min，之后明顯的β-catenin磷酸化一直維持48h；PI3K/AKT磷酸化高峰出

27、現(xiàn)在第15-60min，持續(xù)2h，之后逐漸減弱。分別用0ng/mL，5ng/mL，20ng/mL，40ng/mL和100ng/mL的SDF-1處理HT29細胞30min。結(jié)果顯示，PI3K/AKT和β-catenin磷酸化與SDF-1濃度有關(guān)，隨著濃度增高，二者磷酸化亦逐漸增強，100ng/mL處理處理HT29細胞30min時PI3K/AKT和β-catenin磷酸化最明顯。
　　 6.應(yīng)用AMD3100和LY294002分別阻

28、斷CXCR4/SDF-1信號通路和PI3K/AKT信號分子后發(fā)現(xiàn)，AMD3100能夠阻斷HT29細胞PI3K/AKT和β-catenin磷酸化，LY294002也能夠阻斷PI3K/AKT和β-catenin磷酸化。
　　 結(jié)論:
　　 1.SDF-1能夠促進人結(jié)腸癌HT29細胞的生長；
　　 2.SDF-1能夠增強人結(jié)腸癌HT29細胞侵襲能力；
　　 3.CXCR4/SDF-1信號通路參與了誘導(dǎo)HT29細

29、胞E-cadherin/β-catenin復(fù)合物表達下降；
　　 4.PI3K/AKT和β-catenin磷酸化及E-cadherin/β-catenin mRNA下調(diào)可能是SDF-1誘導(dǎo)HT29細胞E-cadherin/β-catenin下調(diào)的重要原因；
　　 5.CXCR4/SDF-1信號通路引起HT29細胞β-catenin磷酸化是通過PI3K/AKT實現(xiàn)的，β-catenin是PI3K/AKT的下游效應(yīng)因子。