FHL1在胸主動脈夾層發(fā)病機制中的初步研究.pdf

1、目的：研究細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白four and half LIM domain1(FHL1)蛋白在胸主動脈夾層(thoracic aortic dissection,TAD)的表達(dá)變化情況，并觀察其對主動脈血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖能力的影響，揭示其在主動脈壁重構(gòu)中扮演的角色，從而探討FHL1在TAD發(fā)病機制中可能的作用。
　　 方法：收集Stanford A型TAD和

2、正常主動脈(normal aorta,NA)各8例，抽提主動脈組織總蛋白，Bicinchonininc acid(BCA)法測定蛋白質(zhì)濃度，利用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blotting,WB)檢測FHL1在兩組中的表達(dá)情況，Image J圖像分析軟件分析結(jié)果；制作主動脈石蠟組織切片，利用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)進(jìn)一步分析比較TAD與NA中FHL1蛋白表達(dá)的情況，并觀察其在主動脈組織中的具體

3、定位。
　　 標(biāo)準(zhǔn)酶消化法原代培養(yǎng)大鼠主動脈VSMCs，利用RNA干擾(RNAinterference,RNAi)方法研究FHL1對細(xì)胞的增殖和凋亡的作用。設(shè)計合成大鼠靶向FHL1基因的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)作為實驗組，使用脂質(zhì)體為轉(zhuǎn)染試劑瞬時轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠主動脈VSMCs，抑制FHL1基因表達(dá)；同時設(shè)立空白組和陰性對照組，空白組不加轉(zhuǎn)染試劑及siRNA，陰性對照組加入等量的轉(zhuǎn)

4、染試劑及不相關(guān)的siRNA，以排除轉(zhuǎn)染試劑和非特異性干擾對細(xì)胞的影響。轉(zhuǎn)染48h后抽提細(xì)胞總RNA，采用實時熒光定量PCR(real time quantitative polymerase chainreaction,Q-RT-PCR)法檢測FHL1 mRNA表達(dá)抑制情況；轉(zhuǎn)染72h后抽提細(xì)胞總蛋白，利用Western blotting測定FHL1蛋白表達(dá)抑制情況；分別于轉(zhuǎn)染48h、72h、96h后用MTT法檢測細(xì)胞增殖能力的變化情況

5、，并繪制變化曲線；轉(zhuǎn)染72h后采用雙標(biāo)法流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測細(xì)胞的凋亡變化情況。
　　 結(jié)果：Western Blotting分析結(jié)果表明FHL1在TAD患者主動脈組織中表達(dá)水平較正常人明顯降低；IHC染色結(jié)果觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL1主要由主動脈VSMCs表達(dá)，定位于細(xì)胞質(zhì)中，TAD主動脈組織中細(xì)胞FHL1陽性率及陽性強度均明顯降低，在靠近夾層撕開區(qū)域及其鄰近的VSMCs中FHL1表達(dá)下降最為明顯。<

6、br>　　 FHL1靶向RNA干擾顯著有效，干擾后細(xì)胞中該基因表達(dá)的mRNA及蛋白水平均明顯下降，mRNA抑制率為91％，而空白組及陰性對照組FHL1 mRNA及蛋白水平均無明顯改變。MTT法檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA后大鼠主動脈VSMCs的增殖能力明顯降低，48h、72h和96h的Abs抑制率分別為24％、47％和41％；細(xì)胞凋亡水平則無明顯改變，轉(zhuǎn)染siRNA72h后的實驗組、空白組及陰性對照組細(xì)胞的凋亡率分別為2.65±1.16％、