TGF-β1-Smad信號(hào)通路在胸主動(dòng)脈夾層中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:胸主動(dòng)脈夾層(thoracic acute dissection，TAD)是心臟外科急重癥，嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康，其起病急，預(yù)后差。隨著診療技術(shù)的不斷提高，TAD的診出率逐年提高，臨床資料統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率約為3-6/100000。在保守治療下，50-68％的TAD患者在發(fā)病后48小時(shí)內(nèi)死亡，并且隨病程進(jìn)展死亡率呈上升趨勢(shì)。目前治療TAD的方法主要是胸部開(kāi)放手術(shù)及微創(chuàng)下腔內(nèi)隔絕術(shù)，但開(kāi)放手術(shù)時(shí)間長(zhǎng)、術(shù)中操作復(fù)雜，術(shù)后并發(fā)癥較多，腔內(nèi)隔絕

2、術(shù)適應(yīng)證較窄，因此有必要從TAD的發(fā)病原因及機(jī)制方面探究預(yù)防及治療TAD的新的方法，更好地改善患者的預(yù)后。
　　許多研究表明血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的生物學(xué)功能異常參與了TAD的發(fā)生與發(fā)展，其中VSMC的表型轉(zhuǎn)換是關(guān)注的熱點(diǎn)。VSMC存在兩種表型，一種是收縮型（分化型），特點(diǎn)是其調(diào)節(jié)血管壁張力及維持彈性能力強(qiáng)，增殖、遷移功能差，一種是分泌型（去分化型），特點(diǎn)是其增殖、遷移能

3、力強(qiáng)，維持血管壁力學(xué)屬性能力差。正常狀態(tài)下，VSMC主要以收縮型存在，但在比如TAD等病理?xiàng)l件下，VSMC則主要以分泌型存在，這種現(xiàn)象提示我們VSMC的表型轉(zhuǎn)換可能與TAD的發(fā)生發(fā)展有相關(guān)性。
　　已有大量文獻(xiàn)證實(shí)TGF-β1/Smad信號(hào)通路參與生物體內(nèi)眾多生理病理過(guò)程，包括細(xì)胞分化、增殖及凋亡，相關(guān)研究表明TGF-β1/Smad信號(hào)通路參與VSMC的功能異常過(guò)程。TGF-β1/Smad信號(hào)通路無(wú)法直接將信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，其必

4、須與一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合發(fā)揮作用。Nanog被證實(shí)是維持胚胎干細(xì)胞增殖性的重要因子，并且受到Smad2的直接調(diào)控，但關(guān)于Nanog是否可以維持VSMC的增殖性（分泌型）參與TAD的發(fā)病未見(jiàn)報(bào)道。本研究目的是明確TGF-β1/Smad信號(hào)通路是否通過(guò)調(diào)控Nanog促進(jìn)VSMC的表型轉(zhuǎn)換從而誘導(dǎo)TAD的發(fā)病。
　　方法:本研究分為以下三部分。1、收集TAD患者主動(dòng)脈壁組織標(biāo)本（13例）與無(wú)主動(dòng)脈疾病尸檢或捐贈(zèng)者的主動(dòng)脈壁組織標(biāo)本（10例）

5、，利用RT-PCR、WesternBlot實(shí)驗(yàn)技術(shù)在mRNA及蛋白水平檢測(cè)TGF-β1、Smad、Nanog及相關(guān)信號(hào)因子在正常與病變血管壁組織中的表達(dá)有無(wú)差異，利用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)對(duì)比正常主動(dòng)脈組織和TAD主動(dòng)脈組織中TGF-β1、Smad、Nanog及相關(guān)信號(hào)因子表達(dá)量和表達(dá)部位的差異。2、收集無(wú)主動(dòng)脈疾病尸檢病人的新鮮主動(dòng)脈組織，培養(yǎng)中膜層VSMC。用TGF-β1細(xì)胞因子刺激VSMC，以同株人VSMC作對(duì)照，采用RT-PCR及

6、Western Blot技術(shù)對(duì)比TGF-β1細(xì)胞因子刺激組和空白對(duì)照組中Smad2、Smad3及α-SMA的mRNA及蛋白表達(dá)差異。3、收集無(wú)主動(dòng)脈疾病尸檢病人的新鮮主動(dòng)脈組織，培養(yǎng)中膜層VSMC。用TGF-β細(xì)胞因子刺激VSMC，以同株人VSMC作對(duì)照，采用RT-PCR及Western Blot技術(shù)對(duì)比兩類(lèi)細(xì)胞中Nanog及α-SMA的mRNA及蛋白表達(dá)差異;然后以SiRNA干擾VSMC（TGF-β1細(xì)胞因子刺激組）中Nanog基因的

7、表達(dá)，采用RT-PCR及Western Blot技術(shù)驗(yàn)證干擾Nanog前后VSMC中α-SMA的表達(dá)量差異;采用染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，CHIP)技術(shù)驗(yàn)證Smad2是否直接結(jié)合Nanog啟動(dòng)子區(qū)。
　　結(jié)果:
　　1、主動(dòng)脈組織中TGF-β1、Smad、Nanog及相關(guān)信號(hào)因子的表達(dá)情況:RT-PCR結(jié)果表明，TAD組主動(dòng)脈壁組織中TGF-β1、TGFβ-R1、Smad2

8、、Smad3、Smad4、Nanog的mRNA表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組(p＜0.05)。Western Blot結(jié)果顯示，TGF-β1、TGFβ-R1、Smad2、Smad3、Smad4、Nanog蛋白在TAD中表達(dá)水平高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。免疫組織化學(xué)染色表明TAD主動(dòng)脈組織中TGF-β1、TGFβ-R1、Smad2、Smad3、Smad4、Nanog的信號(hào)強(qiáng)于正常對(duì)照組(P＜0.05)。
　　2、TGF-β1、Sma

9、d與VSMC表型轉(zhuǎn)換的關(guān)系:TGF-β1細(xì)胞因子刺激人原代主動(dòng)脈VSMC后，Smad2、Smad3較空白組表達(dá)量上調(diào)(P＜0.05)，α-SMA表達(dá)較空白組下降(P＜0.05)。
　　3、Smad2調(diào)控Nanog促進(jìn)VSMC表型轉(zhuǎn)換的研究:人原代主動(dòng)脈VSMC加入TGF-β1細(xì)胞因子后，Nanog表達(dá)量較空白組上調(diào)(P＜0.05)，α-SMA表達(dá)量較空白組下降(P＜0.05)，然后利用SiRNA干擾Nanog后，α-SMA表達(dá)量上

10、升(P＜0.05); CHIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Smad2結(jié)合于Nanog啟動(dòng)子區(qū)-298bp到-80bp之間。
　　結(jié)論:
　　1、TGF-β1、Smad、Nanog及相關(guān)信號(hào)因子在TAD組表達(dá)量高于正常對(duì)照組，提示其與TAD的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。
　　2、TGF-β1細(xì)胞因子刺激人原代主動(dòng)脈VSMC后Smad2及Smad3 mRNA表達(dá)量上升、α-SMA mRNA表達(dá)量下降，提示TGF-β1、Smad2、Smad3參與V