柚皮苷對體外培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞增殖及分化影響的研究.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)通過采用人牙髓細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法，探討不同濃度柚皮苷對體外培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞增殖、分化、礦化、細(xì)胞周期及堿性磷酸酶(ALP)活性的影響。
　　方法:選擇因正畸或阻生新鮮拔除的健康、完整、無齲、無隱裂的恒牙或第三磨牙，在無菌的條件下取出牙髓組織，采用組織塊酶解法獲取人牙髓細(xì)胞并進(jìn)行原代培養(yǎng)。待細(xì)胞長出后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況。當(dāng)細(xì)胞生長至鋪滿孔底80％時進(jìn)行傳代，細(xì)胞傳代成功后，取第4代對數(shù)生長期人牙髓細(xì)胞進(jìn)行

2、細(xì)胞爬片，用SABC法進(jìn)行波形絲蛋白和角蛋白免疫組織化學(xué)染色鑒定細(xì)胞來源。將處于對數(shù)生長期的第4代人牙髓細(xì)胞用0.25％的胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，以2×104cells/ml密度分別接種于96孔培養(yǎng)板中，每板余出一列培養(yǎng)孔不加液，其余各孔每孔液量200μl，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞貼壁情況良好后棄上清液，PBS緩沖液清洗3次后吸干。將細(xì)胞隨機(jī)分為5個實(shí)驗(yàn)組、1個對照組和1個空白對照組，每組選5個孔。實(shí)驗(yàn)組:在相應(yīng)的有細(xì)胞孔內(nèi)加入200

3、μl用含15％標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液配置的終末濃度分別為10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L的柚皮苷。對照組:在相應(yīng)的有細(xì)胞孔內(nèi)加入200μl含15％標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液?？瞻讓φ战M:在相應(yīng)的無細(xì)胞孔內(nèi)加入200μl含15％標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液。
　　MTT比色法檢測柚皮苷對人牙髓細(xì)胞增殖能力的影響:分別于培養(yǎng)24h、48h和72h時隨機(jī)取出一個96孔培養(yǎng)板，向所測孔內(nèi)加入5

4、mg/mlMTT20μl后繼續(xù)孵育4h，棄孔內(nèi)液體，每孔加入150μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩5min，以空白對照孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測定492nm波長下各孔的吸光度值。
　　CCK-8法檢測柚皮苷對人牙髓細(xì)胞增殖能力的影響:分別于培養(yǎng)24h、48h和72h時隨機(jī)取出一個96孔培養(yǎng)板，棄孔內(nèi)液體，向所測孔內(nèi)加入110μl經(jīng)DMEM稀釋后的CCK-8溶液(DMEM和CCK-8以10∶1配比)，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2小時，用酶標(biāo)儀

5、測定在450nm處的吸光度值。
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測柚皮苷對人牙髓細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響:選用含15％標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液配置的終末濃度為10-7mol/L的柚皮苷作為試驗(yàn)組，與對照組（15％標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液）進(jìn)行細(xì)胞周期試驗(yàn)。按照細(xì)胞周期試劑盒說明書操作，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。
　　檢測柚皮苷對人牙髓細(xì)胞的堿性磷酸酶活性的影響:分別在藥物作用24h、48h和72h隨機(jī)取出一個96孔培養(yǎng)板，棄上清液，P

6、BS緩沖液清洗3次后吸干，每孔加入50μl0.1％TritonX-100，置于4℃冰箱過夜。觀察細(xì)胞已無完整結(jié)構(gòu)，經(jīng)震蕩后，按堿性磷酸酶試劑盒說明書加入堿性磷酸酶底物，每孔100μl，在培養(yǎng)箱內(nèi)置30min，最后每孔加入0.2mol/LNaOH50μl終止反應(yīng)，以空白對照孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測定410nm下各孔的吸光度值。
　　茜素紅染色法檢測柚皮苷對人牙髓細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成的影響:選用第4代生長良好的牙髓細(xì)胞，制備2×104cell

7、s/ml細(xì)胞懸液，接種于六孔板內(nèi)。分為對照組和10-7mol/L濃度的柚皮苷處理后的實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)3個復(fù)孔。分別培養(yǎng)14d、28d后，進(jìn)行茜素紅染色，觀察礦化結(jié)節(jié)的形成。
　　柚皮苷對人牙髓細(xì)胞牙本質(zhì)涎磷蛋白mRNA表達(dá)的影響:選用第4代生長良好的牙髓細(xì)胞，制備2×104cells/ml細(xì)胞懸液，接種于六孔板內(nèi)。以含15％標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液配置的終末濃度為10-7mol/L的柚皮苷作為試驗(yàn)組，以15％標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的高

8、糖DMEM培養(yǎng)液作為對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔。分別培養(yǎng)24h、48h、72h后PBS清洗3遍，加入Trizol試劑1ml，反復(fù)吹打至細(xì)胞完全溶解，收至無酶EP管中，-80℃冰箱保存。按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測牙本質(zhì)涎磷蛋白基因的表達(dá)。
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件作單因素方差分析，多重比較采用S-N-K法。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:

9、r>　　1牙髓細(xì)胞的免疫組化染色結(jié)果顯示為抗波形蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性。從而證實(shí)牙髓細(xì)胞的組織來源為中胚層間充質(zhì)細(xì)胞并且無上皮細(xì)胞混雜，符合實(shí)驗(yàn)要求。
　　2與對照組相比，在一定濃度范圍內(nèi)的柚皮苷能促進(jìn)人牙髓細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程，提高其堿性磷酸酶活性，促進(jìn)人牙髓細(xì)胞牙本質(zhì)涎磷蛋白mRNA表達(dá)，并且增強(qiáng)人牙髓細(xì)胞的礦化能力，其中以濃度為10-7mol/L的柚皮苷作用最為明顯。
　　結(jié)論:柚皮苷可促進(jìn)體外培養(yǎng)的人牙髓細(xì)