體外連續(xù)培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞干性特征改變的相關(guān)研究.pdf

1、牙髓干細(xì)胞（Dental pulp stem cell，DPSCs）是成體干細(xì)胞（Adult-derived stem celsl,ASCs）家族的重要成員之一，起源于神經(jīng)嵴來(lái)源的間充質(zhì)細(xì)胞[1]，是從牙髓組織中提取分離出來(lái)的少量具有干細(xì)胞特性的未分化細(xì)胞。特定誘導(dǎo)條件下可定向分化為骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)、肝、心肌等多種組織細(xì)胞[2]。因其具有較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMM

2、SCs）更高的分化程度，以及取材簡(jiǎn)單，創(chuàng)傷小，來(lái)源廣泛，較強(qiáng)的分化潛能和自我更新能力[3]，目前被認(rèn)為是組織工程學(xué)理想的種子細(xì)胞。但原代培養(yǎng)獲得人牙髓干細(xì)胞數(shù)量有限，須經(jīng)體外擴(kuò)增才能獲得足夠的種子細(xì)胞，而已有研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)環(huán)境下會(huì)出現(xiàn)不同程度的衰老，有關(guān)牙髓干細(xì)胞體外連續(xù)傳代后生物學(xué)活性的改變尚不明確。
　　研究目的：本研究旨在通過(guò)觀察牙髓干細(xì)胞在體外連續(xù)傳代后細(xì)胞增殖、分化和自我更新能力等的變化，以探究體外培養(yǎng)環(huán)

3、境對(duì)牙髓干細(xì)胞干性的影響，為研究干細(xì)胞干性維持機(jī)制以及指導(dǎo)牙髓干細(xì)胞組織工程學(xué)臨床應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下：
　　1.人牙髓干細(xì)胞（Human Dental Pulp Stem Cells，HDPSCs）分離、培養(yǎng)、純化和鑒定
　　采用I型膠原酶消化結(jié)合組織塊貼壁法分離獲得人原代牙髓細(xì)胞（Human Dental Pulp Cells，HDPCs）,有限稀釋法挑選單克隆純化牙髓細(xì)胞；流式細(xì)胞儀檢測(cè)

4、表明細(xì)胞高表達(dá)CD29、CD90、CD105、CD146和Stro-1表面標(biāo)記分子，但CD34、CD45表達(dá)陰性，說(shuō)明所獲細(xì)胞來(lái)源于間充質(zhì)；茜素紅染色、ALP染色和油紅O染色陽(yáng)性結(jié)果證實(shí)細(xì)胞具有向成牙本質(zhì)/成骨細(xì)胞以及成脂細(xì)胞分化能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明已成功培養(yǎng)獲得hDPSC。
　　2.連續(xù)傳代對(duì)hDPSCs形態(tài)、細(xì)胞表型以及衰老的影響
　　體外二維條件培養(yǎng)hDPSCs并連續(xù)傳代，分別以P4、P8、P12、P16、P20 hDP

5、SCs為研究對(duì)象，結(jié)果顯示：(1)P4 hDPSCs形小、呈圓形，隨著代數(shù)的增加，細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)椴灰?guī)則，體積變大。（2）流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各代hDPSCs表面標(biāo)記物CD29、CD90表達(dá)無(wú)明顯差異（P>0.05），而與間充質(zhì)干細(xì)胞密切相關(guān)的 CD105、CD146表達(dá)隨代數(shù)增加逐漸降低（P<0.05）。（3）SA-β-半乳糖苷酶染色顯示 P4 hDPSCs無(wú)明顯的衰老現(xiàn)象，但P16、P20衰老細(xì)胞比例顯著上調(diào)（P<0.01）。

6、　　3.體外連續(xù)培養(yǎng)hDPSCs增殖、分化以及克隆形成能力的影響
　?。?）MTT檢測(cè)結(jié)果顯示P4 hDPSCs增殖最快，隨后增殖能力逐代降低（P<0.05）。細(xì)胞周期結(jié)果顯示各代S期細(xì)胞所占總細(xì)胞數(shù)比例隨代數(shù)增加呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。（2）分化能力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)體外誘導(dǎo)各代 hDPSCs成牙本質(zhì)/成骨細(xì)胞向分化14天，茜素紅著色隨代數(shù)的增加逐漸變淺，鏡下觀礦化結(jié)節(jié)數(shù)減少，Real-time PCR檢測(cè)顯示成牙本質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)記蛋白 DSPP,R

7、UNX2 mRNA表達(dá)水平隨代數(shù)的增加而降低（P<0.05）。體外誘導(dǎo)hDPSCs成脂向分化30天，油紅O染色結(jié)果顯示脂滴形成數(shù)隨代數(shù)的增加而減少，Real-Time PCR檢測(cè)PPAR-γ隨代數(shù)的增加而降低（P<0.05）。（3）甲苯胺藍(lán)染成纖維細(xì)胞集落形成率（Colony forming unit fibroblastic，CFU-F）實(shí)驗(yàn)顯示隨代數(shù)的增加，克隆結(jié)節(jié)形成數(shù)目逐漸減少，表明 hDPSCs隨體外傳代次數(shù)的增加克隆形成能力

8、降低，自我更新能力減弱。（4）RT-PCR檢測(cè)各代 hDPSCs內(nèi)生長(zhǎng)因子IGF-2、TGF-β、HGF、FGF-2、VEGF、EGF、FGF-4、IL-6表達(dá)情況，結(jié)果顯示FGF、TGF-β隨代數(shù)增加表達(dá)減少，IGF-2、HGF、VEGF表達(dá)在P8 hDPSCs時(shí)顯著增強(qiáng)，HGF在P20 hDPSCs中出現(xiàn)一過(guò)性的高表達(dá)，hDPSCs不表達(dá)EGF、FGF-4、IL-6。
　　4.連續(xù)傳代對(duì)干性相關(guān)因子表達(dá)的影響
　　(1)

9、 Real-time PCR檢測(cè)各代hDPSCs Oct4可變剪接體（Oct4A，Oct4B）以及干性分子(Sox2、Klf4、c-Myc和Nanog）表達(dá)改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)剪接體Oct4A和干性分子（Sox2，Klf4，c-Myc，Nanog）在hDPSCs中表達(dá)，Oct4A表達(dá)量隨代數(shù)增加無(wú)明顯變化（P＞0.05），而c-Myc表達(dá)顯著上調(diào)后又逐漸下調(diào)，干性基因Sox2，Klf4和Nanog表達(dá)隨代數(shù)增加呈降低趨勢(shì)（P＜0.05），但各

10、代hDPSCs剪接體Oct4B表達(dá)均為陰性。
　　(2)激光共聚焦顯微鏡觀察連續(xù)傳代Oct4A定位改變，發(fā)現(xiàn)P4、P8 hDPSC中，Oct4A主要表達(dá)于細(xì)胞核，P12 hDPSCs中Oct4A表達(dá)逐漸從胞核向胞漿轉(zhuǎn)位。P16、P20 hDPSCs中Oct4A表達(dá)主要定位于胞漿，提示Oct4A轉(zhuǎn)位可能與干細(xì)胞干性的減弱有關(guān)。
　　綜上所述，本研究初步證明hDPSCs在體外擴(kuò)增培養(yǎng)過(guò)程中其增殖、成牙本質(zhì)/成骨向分化能力、自我更

11、新能力等干性特征逐漸減弱，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，干性相關(guān)分子中Sox2、Klf4和Nanog表達(dá)隨代數(shù)增加呈降低趨勢(shì)，而Oct4可變剪接體Oct4A表達(dá)量隨代數(shù)增加雖無(wú)明顯改變但出現(xiàn)胞核向胞漿轉(zhuǎn)位，提示可能干性分子Sox2、Klf4和Nanog以及Oct4A可能在hDPSCs干性維持中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，本課題今后進(jìn)一步的研究將集中探討干性分子Sox2、Klf4和Nanog以及Oct4A轉(zhuǎn)位改變的功能作用，以期尋找到維持hDPSCs干性的的