骨髓間充質(zhì)干細胞與牙髓細胞共培養(yǎng)體系在牙髓再生中應(yīng)用研究.pdf

1、目的：體外建立骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMMSCs）與牙髓細胞（Dental Pulp Cells，DPCs）的共培養(yǎng)體系，觀察和評價兩種細胞在共培養(yǎng)后各自細胞特性的變化和相互影響，探索最佳的兩種細胞在共培養(yǎng)體系中的細胞比例和培養(yǎng)時間，體內(nèi)評估該共培養(yǎng)體系培養(yǎng)后的細胞應(yīng)用于牙髓再生中的可行性，為牙髓再生種子細胞的選擇提供新思路及實驗基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、體

2、外分離、培養(yǎng)及鑒定BMMSCs和DPCs。將細胞在0.4μm的Transwell小室中進行共培養(yǎng)，分組情況如下：①單一BMMSCs；②單一DPCs；③BMMSCs和DPCs共培養(yǎng)組。共培養(yǎng)6天后，用MTT法繪制以上各組細胞的生長曲線并分別提取RNA及蛋白，分別進行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及蛋白免疫印跡（WB）檢測牙本質(zhì)涎磷蛋白（DSPP）、堿性磷酸酶（ALP）、基質(zhì)細胞抗原-1（Stro-1）和CD145的表達情況。
　　2、為探索

3、最佳的共培養(yǎng)細胞比例和體外共培養(yǎng)時間，將細胞在0.4μm的Transwell小室中進行共培養(yǎng)，BMMSCs與DPCs按照10:1、1:1、1:5和1:10的比例分別共培養(yǎng)3、6、9、12天。提取以上各組細胞的mRNA，qPCR檢測DSPP、ALP、Stro-1和CD146的表達并進行統(tǒng)計學分析。
　　3、將人牙牙根段的根管進行機械及化學預(yù)備，將牙根段隨機分為4組，每組4個樣本，將不同的細胞成分在水凝膠支架中混勻，并注入根管內(nèi)，分組

4、情況如下：①BMMSCs組；②DPCs組；③共培養(yǎng)組；④水凝膠支架空白組。將以上制備好的牙根段，移植到裸鼠背部，6周后取出標本，制作HE染色切片，并于顯微鏡下觀察組織生長情況。
　　結(jié)果：
　　1、分離培養(yǎng)的SD大鼠骨髓間充質(zhì)細胞，24小時后可見細胞貼壁呈比較均一的圓球狀，3天后呈長梭形、紡錘樣，隨著培養(yǎng)時間延長，細胞增殖分裂聚集呈簇似漩渦樣。流式細胞儀檢測間充質(zhì)干細胞表面標記物CD29,CD44表達陽性；造血干細胞標記物C

5、D45，CD34表達陰性。用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基及成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)21天、21天和14天后，分別進行茜素紅、油紅O及阿爾新藍染色陽性。牙髓細胞傳至第三代后形態(tài)均一，長梭形，呈成纖維樣細胞形態(tài)。免疫組織化學染色提示，角蛋白染色陰性，而波形絲蛋白染色陽性，提示培養(yǎng)的牙髓細胞為間充質(zhì)來源，可用于后續(xù)實驗。
　　2、通過共培養(yǎng)體系，可以提高BMMSCs牙髓細胞特異標志物DSPP和ALP的表達，降低干細胞標志物Stro-1和

6、CD146的表達，顯示有向牙髓細胞向分化的趨勢；同時也可以提高DP Cs干細胞標志物的表達，降低牙髓細胞標志物的表達，提示有去分化的趨勢，激活分化為其它細胞的潛能。
　　3、共培養(yǎng)細胞比例與時間改變，會對共培養(yǎng)細胞的分化情況有明顯影響。在BMMSCs與DPCs按照1：1與1:5的比例共培養(yǎng)時，可以較高效的誘導(dǎo)B MMSCs分化及DPCs表達干細胞特異標記物；體外共培養(yǎng)條件下，BMMSCs牙髓細胞標志物表達增加、干細胞標志物表達下降

7、在共培養(yǎng)9-12天增加更為明顯，DPCs干細胞標記物在共培養(yǎng)6-9天增加明顯。
　　4、BMMSCs與DPCs按照1:1比例共培養(yǎng)9天，并裝配至多肽水凝膠支架充盈至經(jīng)機械化學預(yù)備后的根管內(nèi)，牙根段移植至裸鼠背部6周后，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組能再生組織結(jié)構(gòu)與正常牙髓相似的類牙髓組織，而單一細胞組再生組織量較少且組織結(jié)構(gòu)與正常牙髓差異較大。
　　結(jié)論：
　　1、在共培養(yǎng)體系中，BMMSCs與DPCs相互影響，增殖速率及mRNA、蛋白

8、的表達發(fā)生變化；BMMSCs受DPCs的影響出現(xiàn)牙髓細胞向分化的趨勢，D PCs出現(xiàn)去分化表現(xiàn)，結(jié)果提示共培養(yǎng)條件在一定程度可調(diào)控共培養(yǎng)細胞的增殖與分化，用低比例的DPCs獲得更多來源的適合牙髓組織再生的種子細胞。
　　2、在BMMSCs與DPCs共培養(yǎng)體系中，細胞共培養(yǎng)比例為1:1、1:5，體外共培養(yǎng)時間為9天左右時，細胞增殖與分化互相影響最為明顯。
　　3、體內(nèi)皮下異位實驗的結(jié)果顯示，該共培養(yǎng)體系培養(yǎng)的細胞可以作為牙髓組