體外無血清分離及培養(yǎng)人角膜上皮干細(xì)胞重建眼表的研究.pdf

1、背景:角膜上皮細(xì)胞的更新來源于角膜上皮干細(xì)胞，目前研究顯示角膜上皮干細(xì)胞主要存在于角膜緣部位，又稱角膜緣干細(xì)胞。臨床上由于嚴(yán)重的化學(xué)燒傷、熱燒傷、電離輻射、嚴(yán)重炎癥、Stevens Johnson綜合征等，可以導(dǎo)致角膜緣干細(xì)胞缺乏或功能障礙，引起視力下降甚至喪失，治療尤為棘手。隨著組織工程技術(shù)的飛速發(fā)展，體外分離及培養(yǎng)人角膜上皮干細(xì)胞，用于角膜緣上皮片的構(gòu)建，通過臨床移植進(jìn)行眼表重建，成為非常有應(yīng)用前景的治療手段。
　　對于角膜上

2、皮干細(xì)胞的體外培養(yǎng)，國內(nèi)外研究學(xué)者多采用SHEM(supplemental hormonal epithelial medium)培養(yǎng)液進(jìn)行角膜上皮干細(xì)胞的培養(yǎng)，但SHEM培養(yǎng)液中含有一定量的胎牛血清，容易促進(jìn)角膜上皮干細(xì)胞的分化，且胎牛血清中動(dòng)物源性成分復(fù)雜，不利于研究成果的臨床轉(zhuǎn)化。面對體外培養(yǎng)的干細(xì)胞另一難題就是分離，國內(nèi)外文獻(xiàn)中報(bào)道的分離技術(shù)有免疫磁珠分離技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)等，但免疫磁珠分離技術(shù)價(jià)格昂貴，不利于廣泛開展;流式細(xì)胞術(shù)

3、需要標(biāo)記細(xì)胞，且不易無菌操作，都存在一定弊端。
　　體外構(gòu)建人角膜緣上皮片的方法也有多種，國內(nèi)外文獻(xiàn)中報(bào)道較多的方法是氣液界面，但是該方法多在SHEM培養(yǎng)體系下完成;文獻(xiàn)報(bào)道中研究比較熱的培養(yǎng)方法是3D培養(yǎng)法，但是構(gòu)建細(xì)胞外支架的基質(zhì)多是鼠源性的，價(jià)格昂貴，構(gòu)建的上皮片在眼科臨床上并沒有廣泛應(yīng)用。
　　第一部分:活體及離體條件下對角膜上皮干細(xì)胞的定位研究
　　目的:本研究通過活體激光掃描角膜共焦顯微鏡及免疫熒光染色技術(shù)

4、對角膜上皮干細(xì)胞進(jìn)行定位研究，為角膜上皮干細(xì)胞的體外培養(yǎng)提供取材范圍指導(dǎo)。
　　方法:收集2009年9月～2012年9月來河南省眼科研究所就診的單側(cè)角膜緣干細(xì)胞缺乏患者，使用活體激光掃描角膜共焦顯微鏡檢查患者雙眼，健側(cè)眼為對照。掃描方位依次為中央角膜及上、下、左、右方的角膜緣，記錄角膜及角膜緣上皮各層、前彈力層的掃描圖像，對檢查資料進(jìn)行研究和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。眼球材料來自于河南省眼庫，切取角膜中央和角膜緣組織，組織包埋劑包被、切片，切片

5、厚度5～7μm;免疫熒光染色技術(shù)檢測p63、ABCG2、CK19、CD29、K3、Connexin43和involucrin在角膜中央及角膜緣上皮層的表達(dá)，激光掃描共焦顯微鏡觀察拍照并記錄分析。由內(nèi)向外將角膜緣上皮層三等分，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測不同部位的角膜緣上皮層中p63、ABCG2及K3的mRNA表達(dá)，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行相對定量分析。
　　結(jié)果:共有24位患者確診為單側(cè)角膜緣干細(xì)胞缺乏，男19例，（36.00±12.24

6、）歲，女5例，（38.60±5.41）歲。健側(cè)眼在活體激光掃描角膜共焦顯微鏡下的表現(xiàn):角膜中央各層細(xì)胞形態(tài)清晰可見，前彈力層可見平行走行的神經(jīng)纖維;角膜緣上皮層中可見Vogt柵欄、柵欄間形成釘突結(jié)構(gòu)及伴行的色素細(xì)胞?；紓?cè)眼示角膜中央典型的上皮細(xì)胞形態(tài)消失，結(jié)膜化的角膜區(qū)域出現(xiàn)結(jié)膜上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞以及角膜新生血管;前彈力層平行走行的神經(jīng)纖維消失，上皮層下可見樹突狀細(xì)胞;角膜緣區(qū)域Vogt柵欄狀結(jié)構(gòu)消失，色素細(xì)胞消失，取而代之的是大量纖維

7、瘢痕化組織。免疫熒光染色示表達(dá)ABCG2和p63的細(xì)胞主要在角膜緣上皮基底層，尤其在近結(jié)膜側(cè)的角膜緣及角膜緣中間部表達(dá)相對較高，而中央角膜上皮層細(xì)胞不表達(dá);CK19及CD29在角膜緣上皮基底層的表達(dá)強(qiáng)于基底層以上的上皮細(xì)胞，在中央角膜上皮全層也有大量表達(dá);K3、Connexin43及Involucrin在角膜緣上皮基底細(xì)胞層不表達(dá)，中央角膜上皮全層表達(dá)。Real-timePCR檢測示p63及ABCG2mRNA的表達(dá)主要集中在近結(jié)膜側(cè)的角

8、膜緣及角膜緣中間部的上皮層。
　　小結(jié):細(xì)胞分子蛋白檢測提示角膜上皮干細(xì)胞主要存在于近結(jié)膜側(cè)的角膜緣及角膜緣中間部的上皮基底層，這與活體激光掃描角膜共焦顯微鏡觀察到干細(xì)胞存在的微環(huán)境-釘突分布是一致的。
　　第二部分:微孔濾網(wǎng)聯(lián)合水浴處理的羊膜體外分離人角膜上皮干細(xì)胞
　　目的:探索利用無血清培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行角膜緣上皮干細(xì)胞的體外擴(kuò)充培養(yǎng)，以及對培養(yǎng)的上皮干細(xì)胞采用微孔濾網(wǎng)聯(lián)合水浴處理的羊膜粘附進(jìn)行體外分離。
　　方

9、法:角膜緣組織來自直徑小于8mm的穿透角膜移植術(shù)后的供體眼球材料，解剖顯微鏡下剖取角膜緣上皮層外2/3區(qū)域，浸泡于K-SFM(Keratinocyte-serum freemedium)培養(yǎng)液中，37℃，5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育12小時(shí)。組織塊以上皮面向下貼壁，置于37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12h后換液，以后隔日換液。每天于相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長變化，記錄拍照。組織塊周邊有細(xì)胞游離出貼壁生長記作“培養(yǎng)第1天”，分別取培養(yǎng)

10、第5、10、14天的原代培養(yǎng)細(xì)胞為標(biāo)本，免疫熒光染色檢測K3、p63及ABCG2的表達(dá)。細(xì)胞融合面積達(dá)90％以上時(shí)，0.25％Trypsin/0.02％EDTA作用5mins，終止，離心收集細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，依次使用孔徑40μm和30μm細(xì)胞濾網(wǎng)收集直徑小于30μm的細(xì)胞。按照5×104/cm2的細(xì)胞密度接種于去上皮后60℃水浴處理的羊膜載體上，依據(jù)細(xì)胞貼壁時(shí)間不同，共分4組:5mins組、10mins組、20mins組及40mins

11、組，達(dá)貼壁時(shí)間后，棄去未貼壁細(xì)胞，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。免疫熒光染色技術(shù)檢測4個(gè)時(shí)段貼壁細(xì)胞K3及p63的表達(dá)。選取4組中分離到角膜上皮干細(xì)胞相對較高組繼續(xù)培養(yǎng)，隔日換液，每天于相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長變化，記錄拍照。免疫熒光染色技術(shù)檢測膜片中第1、3、5、7、9天的p63及K3的表達(dá)，計(jì)算陽性細(xì)胞比例，采用冰凍切片技術(shù)和H-E染色技術(shù)觀察細(xì)胞層數(shù)。
　　結(jié)果:原代細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察:培養(yǎng)第5天，有大量細(xì)胞從組織塊

12、游離出貼壁生長，細(xì)胞增殖旺盛，部分細(xì)胞內(nèi)可見到雙核;細(xì)胞膜片上粘附有少量從組織塊上脫落的細(xì)胞;培養(yǎng)第10天，細(xì)胞核清晰可見，細(xì)胞連接及終末分化細(xì)胞少見，膜片上小體積細(xì)胞較多，聚集成灶狀分布;培養(yǎng)第14天，可見細(xì)胞克隆，克隆灶內(nèi)細(xì)胞體積較小，形態(tài)均一。免疫熒光染色檢測ABCG2、p63、K3在培養(yǎng)第5、10、14天原代細(xì)胞中的表達(dá):培養(yǎng)第五天，K3表達(dá)量較多，p63有少量表達(dá)，未檢測到ABCG2的表達(dá);培養(yǎng)第十天，K3的表達(dá)量增多，p63

13、表達(dá)量較培養(yǎng)第五天有明顯增多，ABCG2也有少量表達(dá);培養(yǎng)第十四天，表達(dá)ABCG2、p63及K3的陽性細(xì)胞比例分別為:(24.80±3.88)％、(39.46±4.74)％、(40.71±5.38)％。免疫熒光染色檢測4組中貼壁細(xì)胞p63及K3的表達(dá):細(xì)胞貼壁5mins組中貼壁細(xì)胞相對較少，表達(dá)p63及K3陽性細(xì)胞數(shù)低于10mins組，20mins組及40mins組(P＜0.05);細(xì)胞貼壁10mins組，20mins組及40mins組

14、中貼壁細(xì)胞較多，20mins組和40mins組中表達(dá)p63的陽性細(xì)胞比例低于10mins組(P＜0.05)，貼壁10mins組中表達(dá)K3的陽性細(xì)胞比例低于20mins組和40mins(P＜0.05)。因此，10mins組中p63表達(dá)較高，而K3表達(dá)相對較低，應(yīng)為細(xì)胞貼壁分選較好的時(shí)間點(diǎn)。貼壁10mins分離的細(xì)胞在水浴羊膜載體上繼續(xù)培養(yǎng)，第3天形成單層膜片;隨著培養(yǎng)時(shí)間的變化，p63的表達(dá)逐漸降低而K3的表達(dá)逐漸增高，不同時(shí)間點(diǎn)的切片顯

15、示在培養(yǎng)過程中細(xì)胞膜片為單層。
　　小結(jié):利用無血清培養(yǎng)技術(shù)成功進(jìn)行了角膜上皮干細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)，并采用微孔濾網(wǎng)聯(lián)合水浴處理的羊膜對人角膜上皮干細(xì)胞進(jìn)行了成功分離。
　　第三部分:無血清培養(yǎng)條件下人角膜緣多層細(xì)胞上皮片的體外構(gòu)建
　　目的:探索在該無血清培養(yǎng)條件下構(gòu)建人角膜緣多層細(xì)胞上皮片的方法，維持構(gòu)建上皮片中含有一定比例的角膜緣干細(xì)胞。
　　方法:角膜緣干細(xì)胞的原代培養(yǎng)及分離方法同第二部分。構(gòu)建多層細(xì)胞上皮

16、片所采用的培養(yǎng)液為:DMEM/F12培養(yǎng)基與K-SFM培養(yǎng)液的混合液。為了檢測兩種培養(yǎng)液的合適混合比例，實(shí)驗(yàn)分為4組:對照組:K-SFM培養(yǎng)液;其余三組中DMEM/F12與K-SFM培養(yǎng)液的混合比例分別為:1∶9，3∶7，1∶1。每天于相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長變化，記錄拍照。分化至第七天，免疫熒光染色技術(shù)檢測4組中p63及K3的表達(dá);冰凍切片技術(shù)和H-E染色技術(shù)觀察細(xì)胞層數(shù);依據(jù)p63、K3表達(dá)的陽性細(xì)胞比例和分化的細(xì)胞層數(shù)判定兩種培養(yǎng)

17、液較好的混合比例。貼壁10mins分選到的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長達(dá)融合時(shí)更換分化培養(yǎng)液，記作分化第1天，每天于相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長變化，記錄拍照。免疫熒光染色技術(shù)檢測分化第1、3、5、7天膜片中p63的表達(dá)，冰凍切片技術(shù)和H-E染色技術(shù)觀察細(xì)胞層數(shù)。為了進(jìn)一步檢測構(gòu)建上皮片的活性，將構(gòu)建的上皮片貼壁于六孔板中培養(yǎng)，觀察膜片周邊能否有細(xì)胞游離出貼壁生長，每天于相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長變化，記錄拍照，免疫熒光染色技術(shù)檢測p63表達(dá)。<

18、br>　　結(jié)果:檢測兩種培養(yǎng)液的合適混合比例，對照組及1∶9組中p63表達(dá)較高，K3表達(dá)相對較低，但二者在分化至第七天時(shí)細(xì)胞連接仍形成不完整，利用冰凍切片及H-E染色觀察二者較多區(qū)域?yàn)閱螌蛹?xì)胞膜片;而1∶1組中冰凍切片及H-E染色觀察膜片形成較厚，有3～4層細(xì)胞，相差顯微鏡觀察可見形成均一的細(xì)胞連接，但1∶1組中p63表達(dá)明顯低于其他三組(P＜0.05)，膜片部分區(qū)域過度分化，出現(xiàn)空洞;3∶7組中p63仍有相對較高的表達(dá)，相差顯微鏡觀察

19、也可見形成均一的細(xì)胞連接，未見過度分化形成的空洞，冰凍切片及H-E染色觀察膜片形成較厚，有3～4層細(xì)胞。因此，3∶7比例的混合液是混合比例較好的分化培養(yǎng)液。分選后的細(xì)胞增殖融合，形成單層膜片時(shí)更換分化培養(yǎng)液，在分化培養(yǎng)第五天，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞間的緊密連接逐漸形成，此時(shí)形成的膜片有2～4層細(xì)胞;免疫熒光染色技術(shù)檢測在第1、3、5天膜片中p63均有較高的表達(dá)，但在第1、3天，細(xì)胞膜片較薄，細(xì)胞連接形成不完整，因此在培養(yǎng)第五天前后的膜片較好

20、。將構(gòu)建的上皮片貼壁于六孔板中培養(yǎng)，觀察膜片周邊有細(xì)胞游離出貼壁生長，免疫熒光染色技術(shù)檢測貼壁細(xì)胞中仍有較多的p63表達(dá)，上皮片活性良好。
　　小結(jié):通過混合培養(yǎng)液混合比例的對比，采用3∶7比例混合的DMEM/F12與K-SFM培養(yǎng)液成功構(gòu)建了多層細(xì)胞的人角膜緣上皮片，并且上皮中含有較多的角膜緣干細(xì)胞。
　　第四部分:移植體外構(gòu)建人角膜緣多層細(xì)胞上皮片進(jìn)行眼表重建
　　目的:觀察移植體外構(gòu)建的人角膜緣多層細(xì)胞上皮片進(jìn)行

21、眼表重建的療效。
　　方法:收集2009年～2012年來河南省眼科研究所就診的雙側(cè)角膜緣干細(xì)胞缺乏患者，使用結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)對角膜緣干細(xì)胞缺乏患者進(jìn)行診斷;對于結(jié)膜印記細(xì)胞學(xué)診斷陰性的患者使用活體激光掃描角膜共焦顯微鏡進(jìn)行輔助診斷，檢查患者雙眼，掃描方位依次為中央角膜及上、下、左、右方的角膜緣，記錄角膜及角膜緣上皮各層、前彈力層的掃描圖像，對檢查資料進(jìn)行研究和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用免疫熒光染色技術(shù)及冰凍切片技術(shù)對移植前使用的角膜緣上皮片進(jìn)

22、行檢測，觀察p63的表達(dá)及上皮片的細(xì)胞層數(shù)。取得患者的知情同意，并簽署知情同意書、手術(shù)協(xié)議書后對確診的角膜緣干細(xì)胞缺乏患者進(jìn)行體外構(gòu)建的人角膜緣多層細(xì)胞上皮片的移植。術(shù)后局部應(yīng)用抗生素滴眼液，預(yù)防感染;口服環(huán)孢霉素膠囊及局部應(yīng)用FK506、激素類滴眼液進(jìn)行抗排斥反應(yīng)，每隔三個(gè)月抽血進(jìn)行肝腎功能檢測。患者復(fù)診時(shí)間為術(shù)后1月、3月、6月及1年，以后每個(gè)一年復(fù)診一次，復(fù)診時(shí)記錄視力、眼表裂隙燈檢查及熒光素染色檢查。
　　結(jié)果:共有5位患

23、者（6只眼）入組接受手術(shù)治療，4男1女，平均年齡:(31.00±11.64)歲。采用結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)對10只眼進(jìn)行角膜緣干細(xì)胞缺乏診斷，6只眼結(jié)膜化區(qū)域查到有杯狀細(xì)胞，PAS染色陽性。對另外4只行活體激光掃描角膜共焦顯微鏡檢查:角膜中央典型的上皮細(xì)胞形態(tài)消失，結(jié)膜化區(qū)域可見結(jié)膜上皮細(xì)胞以及杯狀細(xì)胞，結(jié)膜化后角膜新生血管，前彈力層神經(jīng)纖維消失，上皮層下可見樹突狀細(xì)胞;角膜緣區(qū)域Vogt柵欄狀結(jié)構(gòu)消失，色素細(xì)胞消失，取而代之的是大量纖維瘢痕化

24、組織，符合角膜緣干細(xì)胞缺乏的共焦顯微鏡表現(xiàn)。免疫熒光染色技術(shù)對每批移植用的上皮片檢測表達(dá)p63的陽性細(xì)胞比例，每批均在10％以上，冰凍切片技術(shù)及H-E染色檢測細(xì)胞層數(shù)為3～4層。在移植后的1年隨訪中，三眼經(jīng)過移植治療后未見有纖維血管膜及新生血管長入角膜，兩眼角膜周邊1/4象限區(qū)域有少量新生血管長入，另一眼角膜上有纖維血管膜長入，移植治療取得了一定療效。
　　小結(jié):通過構(gòu)建的角膜緣多層細(xì)胞片移植可以治療角膜緣干細(xì)胞缺乏，在一定時(shí)期內(nèi)

25、觀察取得了成功的療效。
　　結(jié)論:
　　1.通過活體激光掃描角膜共焦顯微鏡及免疫熒光染色技術(shù)顯示角膜緣干細(xì)胞主要位于角膜緣外2/3區(qū)域的Vogt柵欄基底部及釘突結(jié)構(gòu)中;
　　2.利用無血清培養(yǎng)技術(shù)成功進(jìn)行了角膜上皮干細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)，并采用微孔濾網(wǎng)聯(lián)合水浴處理的羊膜成功對培養(yǎng)的人角膜上皮干細(xì)胞進(jìn)行分離;
　　3.采用3∶7比例混合的DMEM/F12與K-SFM培養(yǎng)液成功構(gòu)建了多層細(xì)胞的人角膜緣上皮片并能維持上皮