富自體CGF纖維蛋白膜對(duì)體外培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、牙髓干細(xì)胞（dentalpulpstemcells,DPSCs）是一類(lèi)具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，其在一定條件下能夠向特定的細(xì)胞類(lèi)型分化，有作為種子細(xì)胞應(yīng)用于組織工程，達(dá)到修復(fù)和重建牙髓組織及形成牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的潛能。
　　富自體濃縮生長(zhǎng)因子（ConcentratedGrowthFactors,CGF）纖維蛋白被認(rèn)為是第三代血小板濃縮物，其通過(guò)不間斷差速離心自體靜脈血制備而成。CGF中含有多種生長(zhǎng)因子，已有研究

2、證實(shí)其對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells,MSCs）的增殖及礦化具有促進(jìn)作用。
　　目的：采用酶消化法體外分離培養(yǎng)、鑒定人牙髓干細(xì)胞（humandentalpulpstemcells,HDPSCs），分別通過(guò)CCK-8法及堿性磷酸酶定量試劑盒檢測(cè)不同濃度富CGF纖維蛋白膜對(duì)HDPSCs增殖及礦化的作用，為HDPSCs及富自體CGF纖維蛋白膜的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、HDPS

3、Cs的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　選取實(shí)驗(yàn)志愿者，年齡18-25歲，身體健康，口腔衛(wèi)生良好，具有拔除阻生齒的指征及需求。志愿者均在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔頜面外科行智齒拔除術(shù)，拔除的智齒需健康完整，無(wú)齲壞，無(wú)隱裂，無(wú)根尖周組織病變。采用酶消化法對(duì)牙髓組織進(jìn)行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含15％胎牛血清的高糖DMEM。待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)80%后，即可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，首次傳代以1:1傳代，以后按1：3傳代。采用流式細(xì)胞儀對(duì)HDPSCs進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定；

4、繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；通過(guò)對(duì)細(xì)胞成骨及成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)，茜素紅及油紅O染色來(lái)鑒定HDPSCs的多向分化能力。
　　2、CGF纖維蛋白膜制備及分組
　　9mlMedifuge離心機(jī)特殊匹配真空采血試管采取志愿者靜脈血，將試管立即置入Medifuge離心機(jī)，設(shè)置CGF程序，差速離心13分鐘后即可得到富CGF纖維蛋白凝塊，此時(shí)可見(jiàn)采血管內(nèi)血液分為三層，上層為血清，底層為紅細(xì)胞，中間層即為富CGF纖維蛋白。棄去上層血清，將CGF層與底層紅細(xì)

5、胞自交界處分離，將CGF多余液體擠出，便可得到富CGF纖維蛋白膜，將纖維蛋白膜剪成3×3mm大小，置于無(wú)菌生理鹽水中備用。不同濃度的CGF分別加入到不同的實(shí)驗(yàn)組中，將加入一片CGF的實(shí)驗(yàn)組命名為1CGF組，加入兩片CGF的實(shí)驗(yàn)組命名為2CGF組，加入三片CGF的實(shí)驗(yàn)組命名為3CGF組，另設(shè)一不加入CGF的對(duì)照組。
　　3、CGF對(duì)HDPSCs增殖能力的影響
　　取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第4代HDPSCs，以1×104/孔細(xì)胞接種于6

6、孔板內(nèi)，培養(yǎng)24h后棄去原培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入含3個(gè)濃度梯度富CGF纖維蛋白膜的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，對(duì)照組加入不含富CGF纖維蛋白膜的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，以上四組分別于培養(yǎng)后1、3、5、7天棄去原培養(yǎng)液，將6孔板內(nèi)細(xì)胞消化接種于96孔板內(nèi)，加入CCK-8液，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育兩小時(shí)，檢測(cè)各組450nm處吸光度值。
　　4、CGF對(duì)HDPSCs礦化能力的影響
　　取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第4代HDPSCs，以

7、2×105/孔細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24h后棄去原培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入含3個(gè)濃度梯度富CGF纖維蛋白膜的礦化誘導(dǎo)液，對(duì)照組加入不含CGF纖維蛋白膜的礦化誘導(dǎo)液，以上四組培養(yǎng)7天、14天后，棄去原培養(yǎng)液，根據(jù)堿性磷酸酶定量試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各組堿性磷酸酶活性。
　　5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作單因素方差分析，用SNK法和Dunnett’sT3法做兩兩比較，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，P＜0.05差

8、異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、通過(guò)酶消化法進(jìn)行HDPSCs原代培養(yǎng)，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)大體呈梭形，胞體豐滿(mǎn)，包漿豐富，核仁圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD44、CD29呈陽(yáng)性，CD34、CD45呈陰性，細(xì)胞成骨成脂誘導(dǎo)四周后，茜素紅染色可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有紅色鈣化物形成，油紅O染色可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有紅色脂滴形成。
　　2、與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組各CGF濃度均對(duì)HDPSCs的增殖起促進(jìn)作用，且該促進(jìn)作用

9、具有濃度依賴(lài)性，隨著CGF濃度的增加，其促進(jìn)作用增強(qiáng)。
　　3、與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組各CGF濃度均對(duì)HDPSCs的成牙本質(zhì)/成骨分化起促進(jìn)作用，且該促進(jìn)作用具有濃度依賴(lài)性，隨著CGF濃度的增加，其促進(jìn)作用增強(qiáng)。
　　結(jié)論:
　　1、通過(guò)酶消化法培養(yǎng)的HDPSCs，細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，細(xì)胞表面抗原及細(xì)胞分化能力鑒定結(jié)果均符合人牙髓干細(xì)胞生物學(xué)特性。
　　2、一定濃度范圍內(nèi)的CGF對(duì)于HDPSCs的增殖及分化可起到促進(jìn)作