富血小板纖維蛋白對牙髓組織再生性影響的研究.pdf

1、牙髓是牙體組織內(nèi)唯一的軟組織,承擔(dān)著不斷形成牙本質(zhì)和向牙齒硬組織提供營養(yǎng)的重要功能。牙髓因受創(chuàng)或感染導(dǎo)致暴露時(shí),其儲備的未分化間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells,MSCs)遷移至損傷處增殖、分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞,并分泌牙本質(zhì)基質(zhì)形成修復(fù)性牙本質(zhì),這是牙髓自身修復(fù)的潛能,也是活髓保存治療的生物學(xué)基礎(chǔ)。然而傳統(tǒng)的活髓保存方法是利用生物活性分子促進(jìn)損傷牙髓的修復(fù),但生物活性分子在體內(nèi)易被吸收,所需劑量大,限制了其在臨床中的

2、應(yīng)用;此外,齲病、外傷等使牙髓組織因感染而去除后,采用根管治療的方法使牙齒變得易碎,從而降低了牙齒的功能和使用質(zhì)量。因此,學(xué)者們探索采用牙髓干細(xì)胞(dentalpulpstemcells,DPSCs)作為種子細(xì)胞的組織工程方法來修復(fù)和重建牙髓組織,以便使患者獲得更好的生存質(zhì)量。組織工程是模擬體內(nèi)生長因子微環(huán)境,將細(xì)胞—生物材料—生長因子復(fù)合物植入機(jī)體組織、器官病損部位,形成具有特定形態(tài)和功能的相應(yīng)組織、器官,而生物材料在形成新組織過程中

3、逐漸降解吸收。然而生物材料尚存在交叉感染及免疫排斥問題,而生長因子則存在輸送載體選擇、適宜劑量的確定、半衰期的影響及種屬來源免疫反應(yīng)等問題,從而限制了組織工程在牙髓牙本質(zhì)再生領(lǐng)域的臨床應(yīng)用。
　　富血小板纖維蛋白(platelet-richfibrin,PRF)被認(rèn)為是第二代富血小板濃縮物,其制備簡單、完全取自于自體血、不添加任何人工制劑等特點(diǎn),從而避免了倫理道德的爭議及免疫排斥和血液交叉感染的風(fēng)險(xiǎn);其富含多種生長因子,已有研究證

4、實(shí)其對多種MSCs的增殖、分化均具有促進(jìn)作用,因此PRF的出現(xiàn)為牙髓牙本質(zhì)的修復(fù)再生提供了可能性。但PRF復(fù)合牙髓干細(xì)胞植入去髓的牙髓腔后的修復(fù)機(jī)制還不清楚需要進(jìn)一步系統(tǒng)的研究。本課題在體外分離、培養(yǎng)與鑒定犬牙髓干細(xì)胞的基礎(chǔ)上,擬通過體內(nèi)、外研究來評估PRF在牙髓牙本質(zhì)再生中可能發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)以及構(gòu)建組織工程化牙髓牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)的可行性,以期為組織工程化牙髓牙本質(zhì)最終的臨床應(yīng)用提供新的契機(jī)與研究基礎(chǔ)。
　　1.犬牙髓干細(xì)胞的分離、培

5、養(yǎng)與鑒定
　　犬麻醉后,從犬上頜第一磨牙中獲取牙髓,并通過酶消化法分離、培養(yǎng)犬DPSCs,并通過有限稀釋法克隆化傳代培養(yǎng)犬牙髓干細(xì)胞,檢測其克隆形成率;采用流式細(xì)胞儀鑒定干細(xì)胞表面標(biāo)記物;通過MTT及成骨/成牙本質(zhì)誘導(dǎo)、成脂誘導(dǎo)等檢測細(xì)胞的增殖與多向分化能力。
　　2.富血小板纖維蛋白的制備
　　將同一犬麻醉后,一次性注射器于犬頸部采集靜脈全血約10ml,紗布壓迫止血,隨即將血液轉(zhuǎn)入無菌玻璃離心管中,用盛有相同體積水的

6、離心管配平后,立即置于離心機(jī)以3000r∕min離心10min,靜置3~5min即可得到纖維蛋白凝塊,此時(shí)血液分3層,中間層即為PRF凝膠。將其中多余的液體擠出,即可獲得柔韌的纖維蛋白膜。將PRF縱向剪開使紅端均勻分部,將PRF分為1/8PRF、2/8PRF、3/8PRF組,在實(shí)驗(yàn)第1d將PRF加入相應(yīng)培養(yǎng)液中,與細(xì)胞共培養(yǎng)7d后去除,用于觀察不同濃度PRF對犬牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。
　　3.富血小板纖維蛋白對基于DPSCs的牙

7、髓牙本質(zhì)再生效應(yīng)的影響
　　將不同濃度的PRF加入正常培養(yǎng)液及成牙本質(zhì)/骨成誘導(dǎo)液,研究PRF對DPSCs體外增殖及成牙本質(zhì)/成骨能力的影響。結(jié)果表明:不同濃度PRF在7d連續(xù)培養(yǎng)期內(nèi)均能明顯促進(jìn)犬牙髓干細(xì)胞的增殖,該促進(jìn)作用具有明顯時(shí)間依賴性而無PRF濃度依賴性。不同濃度PRF可通過上調(diào)成牙本質(zhì)/成骨早期標(biāo)記基因ALP、DSPP及晚期標(biāo)記基因DMP1來促進(jìn)犬牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)/成骨方向分化,該效應(yīng)既具時(shí)間依賴性又具有PRF濃度依

8、賴性。
　　4.富血小板纖維蛋白對DPSCs的體內(nèi)組織再生能力的影響
　　體內(nèi)研究結(jié)果表明:將PRF復(fù)合犬牙髓干細(xì)胞膜片構(gòu)建DPSCs/PRF雙膜復(fù)合體后植入裸鼠皮下,4w、8w取材后HE及Masson染色發(fā)現(xiàn),DPSCs/PRF雙膜復(fù)合體較單純的DPSCs膜片組具有更強(qiáng)的形成牙髓牙本質(zhì)樣組織的能力。犬取材標(biāo)本HE染色結(jié)果顯示,DPSCs/PRF雙膜復(fù)合體植入組在8w時(shí)有較典型的類牙髓牙本質(zhì)樣組織形成;Masson染色、DS

9、PP及BrdU標(biāo)記細(xì)胞免疫組化發(fā)現(xiàn)髓腔內(nèi)有明顯的血管、成牙本質(zhì)樣細(xì)胞及牙本質(zhì)樣基質(zhì)形成,且植入的犬牙髓干細(xì)胞是新生組織的主要細(xì)胞基礎(chǔ)。
　　綜上所述,自體PRF與犬牙髓干細(xì)胞有良好的生物學(xué)相容性,不同濃度的PRF在犬DPSCs體內(nèi)外增殖與分化中均有促進(jìn)作用,利用PRF的這種特性,本課題組構(gòu)建的新型DPSCs/PRF雙膜復(fù)合體移植物,將牙髓干細(xì)胞與自體PRF有機(jī)結(jié)合,可在異位及原位成功實(shí)現(xiàn)類牙髓牙本質(zhì)再生修復(fù)。該研究所取得的進(jìn)展有望